拟南芥是一种模式植物，其基因组序列测序工作已完成[15-16]。本实验通过对拟南芥克隆耐镉毒性的RNAi突变体和控制关键基因的积累和其机理的阐明，无论在理论上还是在实践中无疑具有重要的意义和价值。

1材料和方法

1.1实验材料

野生型（WT）拟南芥（Col-0），由周口师范学院植物遗传与分子育种重点实验室保存；拟南芥RNAi重组质粒文库，由中国农业科学院生物技术研究所王磊研究员赠予。

棉花大丽轮枝菌（D08061）由中国农业科学院棉花研究所植保研究室朱荷琴研究员提供；茄病镰刀菌（HKLCMBB-FS01）由周口师范学院植物遗传与分子育种重点实验室分离、保存。

大肠杆菌菌株DH5α（Escherichiacoli）和农杆菌菌株GV3101（Agrobacteriumtumefaciens），琼脂糖凝胶PCR纯化回收试剂盒和质粒小提试剂盒，购于艾德莱生物科技有限公司；引物合成和测序，由上海生工生物工程有限公司完成。

实验仪器由植物遗传育种重点实验室提供。

1.2试验方法

1.2.1耐受极限重金属镉拟南芥RNAi突变体（homozygote）的筛选

本实验采用90mg/LCdCl2胁迫的方法，对耐受极限镉浓度拟南芥RNAi突变体进行高密度筛选。将RNAi突变体种子消毒播种于MS+90mg/LCdCl2+潮霉素筛选培养基上，同时播种Col-0于MS+90mg/LCdCl2培养基中作为对照。4℃春化3天，然后置于光照培养箱（22℃，16h光照/18h黑暗，8000Lux光照强度）中培养。培养10天后，将筛选到的抗性苗从培养皿中移到培养介质中，置于22℃左右、16h光照/8h黑暗的培养室内进行培养。同时移栽Col-0幼苗作为对照，覆膜3天，植株长势稳定后去膜。莲座叶长势较好时，用GUS染液进一步进行筛选。拟南芥阳性苗成熟后，分别单株收取拟南芥种子，4℃干燥保存。

1.2.2拟南芥耐极限重金属镉目的基因的克隆

分别剪取100mg的拟南芥RNAi突变体抗性苗和Col-0叶片，采用植物基因组DNA提取试剂盒提取突变体和野生型基因组DNA。以拟南芥RNAi突变体和野生型基因组DNA为模板分别进行PCR检测。

该反应上游引物Fjiance：5’-CAACAGGATTCAATCTTAAGAAAC-3’，下游引物Rjiance：5’-CATATTGCAAAGTCTGAAGACTC-3’。PCR反应为25µl体系：16.2µlddH2O，2.5µl10×Buffer，2.0µldNTP，1.0µl上游引物，1.0µl下游引物，0.3µlTaq酶，2.0µlDNA。PCR反应条件：95℃预变性5min，94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，72℃延伸10min，12℃终止反应。将扩增后的PCR产物经1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3抗性拟南芥基因功能分析

将筛选出的抗性拟南芥种子和野生型拟南芥种子消毒后低密度播种于MS培养基中，4℃春化3天，然后放于光照培养箱中。在幼苗长出第一对真叶时，将幼苗单株分别移栽到不同的培养基中，培养中主要有1/2MS培养基（30瓶左右），MS+90mg/LCdCl2，MS+1g/LPb(NO3)2，MS+5g/L甘露醇，MS+10g/LNaCl，置于光照培养箱中培养一段时间后，测定形态指标（根长、干鲜比）和生理指标（叶绿素含量、可溶性蛋白含量），并进行显微观察（叶片与根形态）。