1.4 动物昼夜节律的特性

动物的昼夜节律规律普遍存在于生物体中，具有内源性、遗传性以及可进行校正。以人类为例，人类一般在白天学习和工作，夜晚则进入休息的状态，这便是昼夜节律最简单的解释了。不仅人类存在昼夜节律现象，很多动物都存在昼夜节律现象，当然斑马鱼也不例外，斑马鱼在白天与夜晚的运动活性也存在差异。但不同的动物一般其昼夜节律周期存在差异，如猫头鹰的节律就与人类的相反。动物的昼夜节律一般由特定的基因调控，这类基因我们称之为“钟基因”。钟基因调控着动物的生物钟系统，生物钟系统有三个基本要素：其一，生物钟系统是生命体联系外界环境至生物钟起搏器的输入途径。其二，生物钟系统是能激发生物振荡的起搏器。其三，生物钟系统是起搏器调节各种输出节律的输出途径[20]。研究动物的生物钟系统也是在间接地研究动物的昼夜节律。

1.5 斑马鱼生物钟

斑马鱼存在三次基因组大复制，在斑马鱼基因组中有多个生物钟基因拷贝，在斑马鱼基因中负向调控因子有per1a、per1b、per2、per3和cry1a、cry1b、cry2a、cry2b，正向调控因子有clock1a、clock1b、clock2和bmal1a、bmal1b、bmal2。在这些基因中，bmal和clock的m RNA在昼夜交替时出现最高峰；per2和cry2的表达高峰出现在早晨；cry1a、cry1b及cry3的表达最高峰则在白天，cry2a及cry2b的最高峰出现在晚间[21, 22]，即不同的调控因子在不同的时间出现其表达的最高峰。

2 实验材料与方法

2.1 实验材料

斑马鱼养殖系统（控制温度、PH恒定）、斑马鱼恒温孵化箱、野生型斑马鱼、斑马鱼鱼卵养殖培养液（NaHCO3、葡萄糖、酵母、纯水）、滴管、96孔板、Danio Vision系统等。

2.2 实验方法

2.2.1 野生型斑马鱼养殖

斑马鱼幼苗和成鱼两者的养殖技巧类似，都讲究“喂食少量多次”。但是，幼苗的养殖如履薄冰，是一个更加艰难的历程，稍有不慎，尸横遍野。因此，斑马鱼养殖需要方法正确、技巧娴熟，才能达到更高的存活率。一般斑马鱼的养殖可分为三个阶段：

第一阶段：1~5dpf，在培养皿中培养。3-4dpf鱼鳔已经发育几乎完全，可自由游动觅食。该阶段需在斑马鱼恒温孵化箱中培养，以喂食草履虫为主，一天两次，需在培养皿污染时及时更换培养液。

第二阶段：6~20dpf，此时可转入玻璃盒培养。幼苗开口进食是关键，需要多次投食，频繁刺激。该阶段需在斑马鱼恒温孵化箱中培养，可喂食草履虫加上少量丰年虾虾粉为主，一天两次，需在培养皿污染时及时用滴管吸出赃物，并加入适量的斑马鱼养殖系统中的流动水，使得幼鱼慢慢适应斑马鱼养殖系统的水环境，为之后的转入斑马鱼养殖系统做准备。

第三阶段：20dpf，此时可转入养殖系统养殖。该阶段需在斑马鱼养殖系统中培养，少量喂食孵化的丰年虾细卵活体，一天两次，需在鱼缸污染时及时用滴管吸出赃物，为斑马鱼提供一个干净的生存环境。该阶段需全程控制系统的温度及PH值，一般温度控制在24～30℃这一范围内，PH值控制在7～8这一范围内。

斑马鱼养殖过程中有两个高死亡率阶段。第一个高死亡率阶段出现在10-13dpf，此时大部分幼苗没有吃到开口鱼饵，而本身卵黄所携带的营养物质已殆尽，造成营养不良甚至死亡。面对此状况有如下的解决方法：

（1）必须将鱼食打磨精细再精细，再过两层细网筛食再投喂。

（2）5-10dpf每日多次投食（>3次），投食少量多次。此为非常关键的时间段，不能抱有偷懒侥幸心理，只有付出更多的时间与精力，才能提高斑马鱼存活率。

（3）及时更换培养液，及时吸出沉在底部的死尸与食物残渣。（注：斑马鱼下唇长于上唇，较容易捕获上层页面飘浮的食物。）