摘要：确定猪链球菌裂解酶PlyGBS1249的酶活结构域，来为改造裂解酶提供一定的理论基础，从而为之后猪链球菌病提供新的防治思路。通过表达纯化PlyGBS1249三个结构域（MurNAc-LAA、CHAP和LysMR），将重组蛋白倍比稀释后，通过浊度递减实验来判断裂菌活性，从而对酶活结构域进行特性分析；利用与GFP串联表达的方式来对裂解酶细胞壁结构域（LysMR）进行功能分析。结果发现，分段表达的结构域 MurNAc-LAA与CHAP具有裂解作用，MurNAc-LAA的裂解活性更接近与全长裂解酶PlyGBS1249，推测MurNAc-LAA是起主要裂解作用的结构域；LysMR-GFP表达纯化的蛋白可结合猪链球菌细胞壁。

关键词：猪链球菌；噬菌体裂解酶；裂解活性；结构域

Enzyme active domain of endolysin PlyGBS1249 in lysogenic phage of Streptococcus suis

Abstract:In order to provide a new idea for the prevention and treatment of swine streptococcosis,we focused on the finding out the functional analysis and key domain of endolysin PlyGBS1249 against Streptococcus suis. The proteins encoded by the three domains of PlyGBS1249 were expressed and purified to be analyzed the characteristics of the enzyme activity domain by turbidity decrease assay and the functional analysis of the cell wall by tandem expression with GFP. LyCHAP and LyMurNAc-LAA both shows lysis activity. LyMurNAc-LAA showed catalytic activity as well as the full-length PlyGBS1249. It is suggested that MurNAc-LAA is the main lysate domain. The purified protein expressed by LysMR-GFP has been found to bind to the cell wall of Streptococcus suis.

Key words:Streptococcus suis; Endolysin; lysis activity ;Catalytic domain

目  录

摘要3

关键词3

Abstract3

Key words3

引言3

1 材料与方法4

1.1 实验材料4

1.1.1 菌种来源4

1.1.2 主要试剂与仪器4

1.1.3 引物设计4

1.2 方法 4

1.2.1 获得目的基因和质粒提取4

1.2.2 双酶切5

1.2.3 连接和转化5

1.2.4 PCR鉴定及测序鉴定6

1.2.5 重组质粒转化至表达菌BL21中6

1.2.6 蛋白的小剂量诱导表达6

1.2.7 SDS-PAGE电泳7

1.2.8 蛋白的大剂量诱导表达7

1.2.9 蛋白纯化与超滤浓缩7

1.2.10 BCA工作液测蛋白浓度8

1.2.11 酶学性质分析8

1．2．12 裂解酶细胞壁结构域的功能分析8

2 结果与分析8

2.1 基因片段的扩增和重组质粒的鉴定8

2.2 重组质粒的测序鉴定9

2.3 蛋白表达的SDS-PAGE电泳检测9

2.4 BCA蛋白浓度检测10

2.5 裂解活性分析10

2.6 裂解酶细胞壁结构域的功能分析11

2.6.1 LysMR-GFP重组质粒鉴定结果11

2.6.2 LysMR-GFP重组质粒的测序鉴定11

2.6.3 LysMR-GFP SDS-PAGE结果及功能分析11

3 讨论 12

3.1 猪链球菌裂解酶的研究进展12

3.2 PlyGBS1249的功能分析及讨论13

致谢13

参考文献13

猪链球菌裂解酶PlyGBS1249酶活结构域的确定

引言

猪链球菌(Streptococcus suis)能引起猪的败血症、脑膜炎、肺炎、多发性关节炎和多发性浆膜炎等；在特定情况下，该菌也能感染人，引起人的急性败血症、脑膜炎、心内膜炎等疾病[1]，是一种重要的人畜共患病病原。而随着抗生素的滥用，耐药性猪链球菌出现，导致猪链球菌病的防治越发困难[2,3,4,5]。基于噬菌体裂解酶的高效、专一的抗菌活性，将其开发成新型的抗菌药物,具有极佳的应用前景，尤其在猪链球菌病的防治中，避免了常规耐药性菌株的出现，可提供更好的保护力，菌体也不会对噬菌体产生抗性，发掘和应用高性能的裂解酶更具理论和实用价值[6,7,8]。研究表明，国内外猪链球菌裂解性噬菌体仅分离到的唯一一种SMP [9]，因此使用其来防控耐药性猪链球菌尚存在一定难度[10]。目前针对猪链球菌2型的噬菌体裂解酶研究有待进一步深入，以找到高效广谱的裂解酶。