虽然PlyGBS1249的裂菌活性已经确认，但对其结构域的功能分析和关键结构域仍尚未明晰，因此本文拟通过分段表达 PlyGBS1249 结构域（MurNAc-LAA；LysMR；CHAP），比较分段后蛋白的裂解特性和基本作用，来确定其核心功能域和活性片段，进而为改造裂解酶提供重要实验数据。

1  材料与方法

1．1  实验材料

1．1．1 菌种来源  

所用猪链球菌CZ130302强毒菌株，分离自2013年3月至5月江苏常州某猪场大量断奶仔猪发病个体，由本实验室保存。

实验所有pET-28a 载体由Takamatsu 构建。

商品化的大肠杆菌DH5α株感受态及BL21 株感受态都购自北京博迈德生物公司，由本实验室保存。

1．1．2  主要试剂与仪器  

主要试剂有：  

1. LB 液体培养基（酵母提取物5g、蛋白胨10g、氯化钠10g，定容至1L，115℃高压蒸汽灭菌20min）

2. LB 固体培养基（酵母提取物5g、蛋白胨10g、氯化钠 10g、琼脂5g，定容至1L，115℃高压蒸汽灭菌20min，当温度降至55℃左右，加入卡那抗性至终浓度为50μg/mL，后倒入无菌一次性培养皿中，冷却后保存在4℃）

3. IPTG（异丙基—β—D—硫代半乳糖苷）

4. 5×PBS（NaCl 40g，KCl 1g，KH2PO4 1g,，Na2HPO4 3.05 g，定容至1 L，稀释5倍使用）

5. 上清溶解buffer（0.5M NaCl 14.61g、20mM Na3PO4 3.8g、30mM 咪唑1.02g，定容至500mL）

6. 上清洗脱缓冲液（0.5M NaCl 14.61g、20mM Na3PO4 3.8g、0.5M 咪唑17.02g，定容至500mL）

7. 冻存液（50%甘油缓冲液）

8. 蛋白胶染色液（考马斯亮蓝R250 1.2g/L ；甲醇：水：乙酸 （5：4：1 或 4.5：4.5：1））

9. 蛋白胶脱色液（甲醇：水：乙酸 （5：4：1 或 4.5：4.5：1））等。

主要仪器有：

低温高速离心机、紫外凝胶成像系统、恒温水浴锅、PCR仪、超声波破碎仪、恒温振荡培养箱、核酸凝胶电泳系统、凝胶成像系统、蠕动泵、超滤浓缩管等。

1．1．3  引物设计

用Oligo6.24 设计引物后，送至擎科公司合成猪链球菌裂解酶PlyGBS1249结构域（MurNac-Laa；LysMR；CHAP）的上下游引物。

表1-1 本研究中所用到的引物

引物名称 引物序列 酶切位点

1249-MurNAc-LAA-F CATGCCATGGGTCATGGACAGGGGCGAAC NcoI

1249-MurNAc-LAA-R CCGCTCGAGTCCTGTTATTGCTGACACAAG XhoI

1249-LysMR-F CATGCCATGGGGCAGACCTATCAAGCACAGAAA NcoI

1249-LysMR-R CCGCTCGAGAACCTTGAGTGTTTGCCCAAC XhoI

1249-CHAP-F CATGCCATGGGACAGTGTGTTGCCTTGGTG NcoI

1249-CHAP-R CCGCTCGAGATTCTGTTCCACACCATCAATAC XhoI

1．2  方法

1．2．1 获得目的基因和质粒提取

1．2．1．1  获得目的基因

模板为猪链球菌裂解酶PlyGBS1249基因组

PCR反应体系为：

Prime-star高保真酶        25μL

上游引物                 2μL

下游引物                 2μL

模板                     2μL

ddH2O                   19μL50μL

体系反应条件为30个循环(98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸1min/1000bp)，72℃延伸10min。

MurNac-Laa的Tm为52.6℃，片段大小为489bp，；LysMR的Tm为51.5℃，片段大小为135bp；CHAP的Tm为52℃，片段大小为249bp。

用1%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物片段大小，片段回收试剂盒回收目的片段。

片段回收具体步骤如下：

(1)回收后目的片段加入Binding Buffer于吸附柱中，比例为1:1，＞12000g离心1min；

(2) 回柱，＞12000g离心1min；

(3) 弃滤液，加700μL Wash Buffer，＞12000g离心1min；  

(4) 重复(3)          

(5) 弃滤液，空离1min，风干吸附柱2-3min；