2.自噬过程

自噬(Autophagy)是真核生物中进化保守的，对细胞内物质进行周转的过程。一些损坏的蛋白或细胞器会被双层膜结构的自噬小泡包裹，送入溶酶体（动物）或液泡（酵母和植物）中，并降解为单糖、 氨基酸等小分子，使其得以循环利用 [9]。在自噬过程中, 细胞内首先形成延伸的杯状膜片将周围细胞质包被以形成一个封闭的双层膜囊泡，就是自噬体, 随后自噬体的外膜与溶酶体膜（在酵母细胞中为液泡）融合, 使内容物暴露于溶酶体的水解酶中, 最终自噬体的内膜与被包裹的物质一同被降解, 所产生的分子会通过溶酶体膜被释放到细胞内回收利用。目前有研究者认为, 自噬体与溶酶体相关的融合过程同液泡与液泡之间的融合所涉及到的蛋白几乎完全一致[10]。

3.HOPS复合体的组成和功能

HOPs复合体由六个79 kDa~123 kDa的蛋白Vps11、Vps 18、Vps 16、Vps 33、Vps 41和Vps 39 构成。其中Vps 11、Vps 33、Vps l8和Vps l6属于C-Vps蛋白复合体，相互作用形成了一个核心复合体；Vps 39通过Vps 11与C-Vps蛋白复合体紧密结合在一起[11]。目前VPS家族已被发现大约80个基因，研究发现，C-VPS家族的突变种的细胞中发现最为严重的细胞生长、运输，细胞器形态上的缺陷，这表明，C-VPS家族在细胞的膜泡运输发挥着关键的作用，对晚期内体和溶酶体的汇集，许多溶酶体的内部的运输途径以及细胞自我吞噬的终末阶段是必要的[12]。HOPS复合体介导了液泡与液泡之间最初的连接，HOPS复合体在液泡之间的融合以及自噬过程中起重要的作用[13]。

3.1酵母细胞中HOPS复合体的研究

酵母细胞中HOPS复合体VPS33亚基与SNARE蛋白质VAM3相互作用，以此来调控液泡膜的相互融合过程。VPS ll和VPS l8则分别与VPS39和VPS4l紧密结合。酵母细胞中VPS41的活性受Yck3激酶和Gyp调节。酵母细胞中是同样的，VPS39可以对Rab7/Ypt7发挥GEF的功能。RLP过表达会引起细胞内晚期内体及溶酶体的膨大和聚集，表明RLP与Rab7的相互作用会使Rab7与膜的结合趋于稳定，因此Rab7与Dynein Motor之间的相互作用会促进膜的融合并且将其运送至高尔基体周围的区域[14]。VPS41通过其羧基端与RLP直接相互作用的蛋白，RLP-HOPs复合体的相互作用中发挥着关键作用[15]。(见图1-1)

图1-1酵母HOPS复合体的结构图[13]

研究发现，通过对酵母基因进行筛选，发现了一些在自噬过程中起关键作用的基因。HOPS复合体中的两个基因VPS39以及VPS41的缺失会导致酵母内GFP-ATG8大量积累。进一步研究表明,是GFP-ATG8与液泡不能发生融合，从而使GFP-ATG8大量堆积。而在HOPS复合体中的另外两个基因VPS16和VPS18缺失的情况下, 自噬融合没有受到影响； 在VPS16和VPS18双敲除的酵母菌株中, 自噬过程也没有受到影响[16]。

3.2植物中HOPS复合体的研究

研究发现VCL1（酵母中HOPs复合体VPS16的同源基因）突变导致胚胎致死，突变胚胎中不含典型的裂解液泡且有大量自噬体堆积[17]。这一结果说明植物中的HOPS复合体与酵母中HOPs复合体一样参与液泡融合的过程。蛋白互作实验表明VCL11与HOPS复合体其它两个亚基AtVPS11 和AtVPS33发生互作，并且共同定位在PVC和液泡膜上 [18]。VCL11突变还会轻微影响了雄配子体的发育过程。拟南芥VPS41突变导致雄性不育，VPS41突变花粉管不能穿越柱头进入胚囊完成受精。实验表明，拟南芥HOPS复合体某些亚基在液泡形成和花粉管极性生长或花粉管与柱头的识别过程发挥了重要作用[19-20]。然而拟南芥HOPS复合体作用机制还有待进一步研究。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 拟南芥种子

拟南芥vps11/+ 突变体购自拟南芥生物资源中心。

野生型拟南芥的种子 Columbia (Col-o)由 Arabidopsis Resource Center 提供。