1．1．2 载体

表 1-1 载体

名称 细菌选择性 植物选择性

pCAMBIA1305.1-GFP 卡那霉素（Kanamycin） 潮霉素（HygromycinB）

pCAMBIA1381Z 卡那霉素（Kanamycin） 潮霉素（HygromycinB）

1．1．3 菌株

表 1-2 菌株

名称 菌株类型 来源

大肠杆菌（Escherichia coli） DH5α 本实验室保存

农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens） GV3101 本实验室保存

1．1．4试剂、酶及各种化学药品

1．1．4．1 抗生素（Antibiotics）：

表 1-3 抗生素

名称 来源 溶剂 母液浓度 终浓度

潮霉素（HygromycinB，简写Hyg） Sigma 水 50mg/mL 25μg/mL

卡那霉素（Kanamycin，简写Kana） Roche 水 50mg/mL 50μg/mL

保存：-20℃冰箱

1．1．4．2 酶（Enzymes）

本实验中所使用的限制性内切酶、 RNase A 以及 RNA 反转录酶等为TaKaRa 产品；高保真 DNA 聚合酶购于 TOYOBO 公司； DNase I 为 Sigma 产品；T4-DNA 连接酶为 NEB 公司产品。

1．1．4．3 试剂盒、引物测序

质粒小提试剂盒在上海捷瑞生物公司购买。PCR产物回收试剂盒（DP204-03）为Takara公司产品。本课题中的引物合成服务以及序列测定服务均由司普金公司、生工生物公司提供。

1．1．5实验仪器

表 1-4 实验仪器

名称 型号

激光共聚焦显微镜 Carl Zeiss公司的LSM710

荧光显微镜 LEICA公司的Leitz DM2500型

凝胶成像系统 Bio-Rad公司的紫外扫描仪

普通离心机 Eppendorf公司的 5415D 型

低温离心机 Eppendorf公司的 5810R 型

电泳仪 北京六一厂生产

电泳槽 DYY-33A型 北京六一厂生产

PCR 仪 Bio-Rad公司的 PTC-100 型

1．2 方法

1．2．1 PCR法鉴定T-DNA插入突变体

1．2．1．1 Edwards 法提取DNA：

1.剪取 1-2 片适当大小的新鲜拟南芥叶片放置于 1.5mL 离心管中，每个离心管中加入 400µL 的爱德华缓冲液，放入小钢珠，在液氮下，摇晃离心管板将叶片研成匀浆；

2.常温下12000rpm 离心 5min；

3.弃沉淀，并将上清液倒入新的 1.5mL 离心管中，加入 400µL 异丙醇并混匀，在-20°C冰箱中放置 30min；

4.常温下12000rpm 离心 5min ，弃上清液；

5.向离心管中加入 400µL 70% 的乙醇，常温下12000rpm 离心 2min ，清洗沉淀，弃上清；

6.将离心管倒扣在吸水纸上沥干剩余的液体，离心管开盖正面朝上放置，在空气中干燥 10-15min；向离心管中加入 30µL 灭菌 dH2O，37°C下过夜，使溶解充分溶解后即可用于 PCR等实验。

1．2．1．2 三引物法鉴定VPS11纯合突变体：

1.构建PCR引物；

2.反应条件: 94°C ，5min；( 94°C ，30 sec，56°C ，30 sec；72°C ，1min) 35 个循环；72°C ，7 min；

3.分析：1.0% 琼脂糖胶电泳分析。