曲克芦丁对内皮细胞老化的影响 (3)

NO试剂盒购于南京建成公司;MCP-1 ELISA试剂盒、IL-8 ELISA试剂盒均购于博士德;CCK-8试剂盒;HUVEC:人脐静脉血管内皮细胞购于美国ScienCell;曲克芦丁; X-ga


NO试剂盒购于南京建成公司;MCP-1  ELISA试剂盒、IL-8  ELISA试剂盒均购于博士德;CCK-8试剂盒;HUVEC:人脐静脉血管内皮细胞购于美国ScienCell;曲克芦丁; X-gal :D9031A购于宝生物工程(大连)有限公司;M199培养液购自凯基生物公司; DMSO、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·12H2O、KH2PO4 、Na2HCO3 、K3Fe(CN)6、K4Fe(CN)6·3H2O、MgCl2·6H2O、DDW、胰酶、胰酶粉、葡萄糖、乙醇、戊二醛、甲醛、N,N二甲基甲酰胺、NaCl、KCl等均购于上海生工;胎牛血清购于美国Gibco公司。

2.3 主要溶液与试剂配方

2.3.1 血管内皮细胞培养液(100 ml)配制方法如下:

取小牛血清20ml,与80ml M199培养液混合均匀,调节pH,储存备用。当实验需要使用时,在混合溶液中加入70mg/ml的生长因子。

2.3.2 10×PBS(1L)配制方法如下:

   准确称取NaCl 80.0g,Na2HPO4·12H2O 28.9g,KH2PO4 2.0g,KCl 2.0g溶于1L DDW中,充分溶解备用。

2.3.3 0.5%的胰酶贮存液配制方法如下:

取胰酶粉5g,加入1L 1×PBS溶液冰浴中低速搅拌,配置好的胰酶储存液要进行抽滤灭菌,分装于小瓶-20℃保存,4℃短期内用完。使用时,将贮存液稀释10倍,即10 ml的0.5%的胰酶贮存液加入90ml的PBS。

2.3.4 30mM D-gal处理液配制方法如下:

称取葡萄糖0.0054g,溶于1L DMSO中,获得浓度为30M的D-gal处理液。

2.3.5曲克芦丁处理液配制方法如下:

称取曲克芦丁0.019g,加入1ml DMSO中,获得浓度为25mM的曲克芦丁储存液。取1μl的储存液与1ml的培养液混匀,得到25μM的曲克芦丁处理液。取2μl的储存液与1ml的培养液混匀,得到50μM的曲克芦丁处理液。取4μl的储存液与1ml的培养液混匀,得到100μM的曲克芦丁处理液。

2.3.6 β-Gal染液,配制方法如下:

准确称取211.0mg K4Fe(CN)6·3H2O,40.7mg MgCl2·6H2O,164.5mg K3Fe(CN)6,以100ml 1×PBS溶液充分溶解,再以柠檬酸调节pH至6.0,4℃储存备用。

2.3.7 助液配制方法如下:

取N,N二甲基甲酰胺1ml,溶解20mgX-Gal配制成20mg/ml的溶液,保存于玻璃管或聚丙烯管中,以铝箔封裹防止光照,-20℃放置。

2.3.8 0.01M PBS配制方法如下:

准确称取药品NaH2PO4·12H2O 0.226g,NaCl 0.900g,Na2HPO4·12H2O 3.473g,以1L蒸馏水充分溶解,定容。