2.3脂肪酸合成关键酶活性位点的鉴定及其分布特点 8

2.4三酰甘油合成关键酶活性位点的鉴定及其分布特点 9

2.5新型产油酵母油脂合成关键酶活性位点的预测 11

2.6新型产油酵母油脂合成关键酶活性位点的改造与评价 13

3讨论 15

4结论 15

5参考文献 16

附录 18

致谢 20

新型产油酵母菌的代谢工程学研究

引言

随着医疗和生活水平的的不断提高，世界人口数量在急剧增长，这加剧了人们对化石能源的需求和消耗，使得能源危机和环境污染成为世界性问题。因此积极开发能替代化石燃料的可再生清洁能源迫在眉睫[1]。类似生物柴油这种生物燃料或者说生物油脂是现阶段我们所找到很适用的可再生清洁能源。其主要化学成分为长链脂肪酸(甲)酯,具有能量高、含硫量低、燃烧充分、润滑性能好、可再生、易降解、储运安全等特点[2],是化石柴油良好的替代品[3]。然而动植物油脂受季节和地理位置的影响，且其中多不饱和脂肪酸(PUFAs)含量往往较低，不能满足日益扩大的市场需求[4]，而且生产周期长、耗费人力资源、并且占用大量的耕地面积,使得生物柴油生产的原料成本相当高昂。和它们相比，微生物油脂具有很多无可比拟的优越性：如生长周期短，繁殖快，可以在短时间内累积大量的生物量(油脂)；其生产可摆脱场地和气候的限制，适合大规模工业化生产；可利用多种工农业废料和廉价原料进行油脂的生产能够减少环境污染。最重要的是微生物细胞结构简单，利于对其进行遗传改造以提高油脂产量和生产特殊的油脂[5]。因此,微生物油脂是具有广阔前景的新油脂资源,可能在未来生物柴油产业中发挥重要作用[6]。

细菌、酵母、霉菌、藻类中都有产油菌株,但以酵母菌和霉菌类真核微生物居多。在酵母、霉菌等真核微生物中,某些产油种属能积累占其生物总量70%以上的油脂,其中以甘油三酯(Triacylglycerol,TAG)为主,约占80%以上,磷脂约占10%以上[7]。这些产油微生物在一定条件下能将碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂等碳源转化为菌体内大量贮存的油脂。研究表明，解脂耶罗威亚酵母(Yarrowialipolytica)有很高的产油能力，是海洋环境中广泛存在的酵母菌之一。该酵母不同菌株能合成大量的胞内蛋白质，油脂，分泌大量柠檬酸，并且能够分泌各种蛋白质，包括蛋白酶(酸性蛋白酶AXP和碱性蛋白酶AEP)、磷酸酶、脂肪酶和RNA酶等，所以该酵母最近几年引起了人们的高度重视[8]。除此之外，解脂耶罗维亚酵母还有许多其他的特点：1)被美国食品药品管理局认为是最安全的微生物，在食品和医药工业上具有广泛的应用前景；2)它作为半子囊酵母菌，是非模式酵母菌中与酒精酵母进化关系最远的3)能够利用葡萄糖、乙醇、乙酸、烷烃、脂类作为碳源，但是不能利用蔗糖；4)在不同的条件下能形成酵母状细胞、假菌丝、真菌丝３种不同的形态。在这些酵母菌表达系统中，解脂耶罗威亚酵母被认为是最有开发潜力的，因为它的表达系统具有以下特点：1)构建的表达质粒含有zeta序列，zeta序列至少为菌株基因组提供了100个潜在的整合位点，使得外源蛋白表达产量高；2)启动子hp4d是１种很强的依赖生长周期的启动子，不用特殊物质的诱导，外源基因就可进行表达，并且可以避免目的蛋白的超表达对宿主细胞的毒害作用；3)适合高密度发酵培养；4)已测定全基因组序列和线粒体DNA序列，遗传背景清晰；5)在这种酵母翻译转运占主导地位，糖基化程度低，使得此表达系统有应用于医药工业的潜力，并且糖基化情况类似于高等真核生物；6)它的胞外碱性蛋白酶基因和酸性蛋白酶基因可以被敲除，避免表达的外源蛋白质随之被蛋白酶降解；7)表达载体是１种穿梭质粒，转化到酵母菌之前，来自细菌的DNA片段(含有卡那霉素抗性基因的片段)可用NotI酶切除，因此转化后的菌株中不含抗生素抗性基因，保证了转化后菌株仍是最安全的微生物；8)某些在其它酵母菌中难以表达的外源蛋白可以在此表达系统中进行尝试表达[9]。因此我们选取解脂耶罗威亚酵母作为我们的研究对象。