1.2治疗糖尿病的药物

通过药物治疗糖尿病的主要目的是使糖尿病患者的生活质量得到改善，降低血糖值到正常水平并保持稳定，尽可能的减少并发症的发生，使患者的寿命延长。目前用于治疗糖尿病的药物主要有口服降糖药和胰岛素，口服降糖药主要有磺酰脲类（疗效突出、价格便宜）、双胍类（肥胖糖尿病患者首选）和葡萄糖苷酶抑制剂（唯一具有糖耐量减低治疗适应症的降糖药）[4]。胰岛素的应用主要是用于存在内源性胰岛素合成与分泌的缺陷以及与营养不良有关等情况的糖尿病的治疗。近几年，以胰高血糖素样肽-1为代表的胃肠激素多肽类药物在治疗糖尿病上受到广泛的关注，研究其降糖作用机制，延长半衰期，达到多肽长效化成为研发新的糖尿病治疗药物的焦点[5]。

1.3胰高血糖素样肽-1的简介

胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是一种调节胰岛素释放的激素[6]，由胰高血糖素原基因表达，血浆葡萄糖的浓度影响促胰岛素的分泌，在空腹状态下，促胰岛素分泌的作用不会发挥，所以相对胰岛素类药物要更安全[7]。除此以外，GLP-1还可以增强胰岛β细胞功能，促进其增殖，同时具有抑制胰岛α细胞分泌胰高血糖素、延缓胃内容物排空、增加饱腹感，减少食物的摄入量等作用[8]。GLP-1虽然有很多优点，但它进入人体后2 min就会被机体降解[9]，临床应用受到极大限制。

1.4脂肪酸化非洲爪蟾GLP-1的设计

天然的GLP-1生物半衰期比较短，在体内容易被二肽基肽酶IV(DPP-IV)降解，同时，在肾脏也易被肾小球滤过代谢[10-11]。前期我们经过研究发现了具有优异降糖活性的非洲爪蟾GLP-1（xGLP-1，图1），但是，xGLP-1的半衰期仍然较短，仍需要进一步的化学修饰以增加化合物的半衰期。脂肪酸具有较高的血清蛋白结合率，将其通过化学修饰手段修饰到多肽肽链上，可以通过增加多肽的血清蛋白结合能力来延长半衰期。但是，脂肪酸化如不能定点、定量的修饰到多肽上，可能会影响多肽的降糖活性。为了实现定点、定量的脂肪酸化修饰，我们首先在xGLP-1的肽链上引入Cys，设计了4个Cys定点突变的xGLP-1衍生物，进一步利用巯基和马来酰亚胺能定点、定量反应的特点，将马来酰亚胺修饰的长链脂肪酸通过巯基直接与肽链相连，从而实现对多肽的特异性脂肪酸化。

图1-1 xGLP-1及4个Cys改构的xGLP-1衍生物的结构

2.实验部分

2.1实验原料及试剂

Rink Amide MBHA树脂、二甲基甲酰胺（DMF）、N-甲基吡咯烷酮（NMP）、Fmoc保护氨基酸、1-羟基苯并三唑（HOBT）、哌啶、三氟乙酸（TFA）、N, N-二异丙基碳二亚胺（DIC）、DIPEA、1, 2-乙二硫醇、苯酚、苯甲硫醚、茚三酮等都是市售的分析纯。

2.2实验仪器

手动合成反应器、MS105型十万分之一天平（瑞士MettlerToledo公司）；高效液相色谱仪（杭州赛智科技有限公司）；万分之一天平（沈阳神宇龙腾天平有限公司）；汉邦制备液相色谱仪（江苏汉邦科技有限公司）；Ultimate3000 analytical液质联用质谱仪（美国Thermo公司）；Thermo Hypersil GoldC18制备柱（250 mm×20 mm，12 μm）；真空冷冻干燥机（大连艾斯伯格冻干技术有限公司）；

2.3实验步骤

2.3.1 Cys改构的xGLP-1衍生物的合成

（1）树脂溶胀

将0.262 g的Rink树脂加入反应器中，与二氯甲烷充分搅拌进行一次溶胀，过滤后加入甲醇搅拌收缩一次，再用二氯甲烷冲洗两次后，在二氯甲烷中进行二次溶胀30 min。滤去二氯甲烷，用DMF冲洗四次，得白色晶体颗粒状树脂。

（2）脱Fmoc保护基

在溶胀后的树脂中加入7 ml 20%的哌啶（配比：20 ml哌啶+80 ml DMF）搅拌15 min，用7 ml DMF冲洗一次后（操作时谨防树脂粘壁），在7 ml 20% 的哌啶中再次搅拌30 min后，7 ml DMF冲洗五次，得到脱Fmoc保护基的树脂。