摘  要：促分裂原活化蛋白激酶MAPK在植物生长发育调节和抗逆过程中发挥着重要作用。利用PCR克隆技术从番茄叶片cDNA中分离出一个促分裂原活化蛋白激酶SlMPK5。利用Gateway技术将该基因构建到植物表达载体35ss-GW-3×HA载体上，得到植物表达双元载体35ss-MPK5-3×HA，经菌液PCR检测成功后将其导入农杆菌中。本研究通过植物表达载体的构建，有助于更好的了解番茄SlMPK5基因的功能。

关键词：番茄；Gateway技术 ；促分裂原活化蛋白激酶

Gene Cloning and Plant Transformation Vector Construction of Solanum lycopersicum MPK5

Abstract: Studies have shown that mitogen-activated protein kinase MAPK play important roles in plant growth regulator and resistance process. We cloned Solanum lycopersicum SlMPK5 from tomato leaves cDNA. Use Gateway reaction with plant expression vector 35ss-GW-3 × HA we generated plant binary vector 35ss-MPK5-3 × HA。After bacterial culture PCR and sequencing confirmation successed constructer introduced into Agrobacterium. This study, contributed for better understanding of the tomato SlMPK5 function.

Key words: Tomato; Gateway Technology; Mitogen activated protein kinase

目    录

摘  要 1

引言 1

1 材料和方法 2

1.1实验材料 2

1.1.1菌株 2

1.1.2质粒载体 3

1.1.3酶和试剂 3

1.2仪器设备 4

1.3实验方法 4

1.3.1 引物干粉稀释 4

1.3.2 KAPA-HiFi高保真酶PCR反应 5

1.3.3检测PCR反应 5

1.3.4 DNA琼脂糖凝胶电泳分析 5

1.3.5电泳后产物纯化 6

1.3.6 BP反应 6

1.3.7 LR反应 6

1.3.8大肠杆菌转化 6

1.3.9 成功培养后挑菌，摇菌 7

1.3.10 保菌 7

1.3.11质粒提取及质粒检测 7

1.3.12农杆菌转化 8

2.结果与分析 9

2.1 KAPA-HiFi高保真酶PCR扩增目的基因 9

2.2 BP反应后质粒检测 9

2.3 LR反应后质粒检测 10

2.4 转化农杆菌 11

3.讨论 12

参考文献 13

致  谢 15

番茄基因SlMPK5的克隆分析及植物转化载体的构建

引 言

番茄（ Solanum lycopersicum ）是茄科番茄属一年或多年生的植物，在我国各地普遍种植，是我国夏秋季主要栽培的一种蔬菜[ ]。近些年来，随着番茄栽培需求量的不断增加，番茄的病虫害也在不断增加，如番茄叶霉病，烟草花叶病毒，枯萎病及青枯病,这些病害都都严重地影响番茄的质量和产量。

促分裂原活化蛋白激酶（MAPK），属于丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶，在进化上是高度保守的，是真核生物信号传递中一个重要的组成部分，参与逆境响应中的多种信号传导途径以及调节植物的生长发育，在真核生物细胞外信号向细胞内传输及放大等过程中起着重要作用[ ]。MAPK级联途径至少有三类蛋白激酶组成MAPKKK、MAPKK和MAPK，胞外信号通过MAPK级联途径中的磷酸化反应使信号由上游传递到下游，并能够被下游的信号蛋白修饰[4]。这些蛋白质参与调控细胞的生长、发育、分化、凋亡和抵御氧化胁迫、低温、高热、紫外辐射、干旱及病原菌侵害等多种信号转导途径。MAPK参与多种信号转导过程并在过程中起信号放大和传递的作用[5]。

最近研究发现，MAPK信号途径参与植物生长多个发育过程的调控[6]。在番茄的基因组中研究发现了SlMPK1、SlMPK2与SlMPK3参与cf-4/Avr4诱导的过敏性反应， SlMPK1和SlMPK3在抗叶霉病菌的反应中起到了一定的作用。但是这些已经了解的番茄MAPK基因的功能只占了番茄MAPK基因家族其中的一部分，大部分的番茄MAPK基因的功能目前仍然不明确，由于番茄在其开花结果期常常会遭遇到许多不良环境的影响[5]如高温、低温、盐渍、干旱等，从而导致严重地影响到番茄的品质与产量，因此，研究番茄MAPK基因族与其表达特性及作用机理之间的关系对于增强番茄抗逆性等有着非常重要的意义[7]。