三、研究方法及措施（拟采取的研究手段及技术路线、实验方案等）

1. 化学成分提取与检测

原料预处理：把新鲜丑柑用蒸馏水洗净擦干后剥下果皮，除去果梗、籽粒等杂质后放置于-80℃冰箱中，24h后再放入冷冻干燥机中干燥，完全干燥后迅速粉碎至200目过筛，制取的丑柑皮粉末存放于-80℃冰箱备用。

提取：称取2g丑柑皮粉末，选择适宜条件（料液比1：20g/mL，超声温度65℃，超声时间30min，乙醇体积分数60%），通过微波辅助超声下萃取黄酮类化合物。

纯化：在4℃下6000rpm/min离心10分钟去除粗杂质，旋转蒸发大部分有机溶剂成膏体后再放入-80℃冰箱中冷冻，再次干燥成提取物粉末，取一定量粉末用甲醇定容，通过0.22μm的微孔滤膜过滤器过滤杂质后上机。

测定：首先对上机条件优化，检测波长选择基于全扫描（190-400nm），选择所有物质都有最大吸收光谱的波长为黄酮类物质的定量检测波长，柱温、流动相类型和流速优化参考相关文献，为了能使结构和性质相似的黄酮类物质能完全实现基线分离，需采用梯度洗脱方式进行分离。

2. 分析方法的考察与数据处理

分析方法考察：通过对线性范围和检出限的测定和精密度实验、重复性实验、加标回收率实验进行方法可行性和稳定性的考察，并通过DPPH、ABTS等方法测定黄酮类物质体外抗氧化活性。

（1）线性范围和检出限：在建立的分析条件下测定一系列质量浓度的标准溶液，以测得的各个黄酮类物质峰面积为纵坐标，质量浓度（mg/L）为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程、相关系数、线性范围和方法检出限。

（2）精密度实验：同一标准混合溶液按建立的色谱条件连续进样6次，测定各标准物质积分峰面积，计算相对标准偏差（RSD）以考察色谱方法的精密度。

（3）重复性实验：在相同色谱条件连续重复测定同一实际样品，平行实验6次，计算各成分积分峰面积的相对标准偏差（RSD）以考察方法的重复性。

（4）加标回收率实验：对同一浓度的样品进行三个水平的甲标回收率实验，每个实验均平行测定3次。计算样品的加标量，进而计算回收率。

数据处理：在保证数据真实、准确的基础上分析随着采摘时期的延长丑柑皮中各黄酮类物质含量的变化，确定提取其中某种黄酮和总黄酮的最佳采摘时期。

四、研究工作的步骤与进度（课题研究在时间和顺序上的安排）

2016.07-2016.08 查找文献、设计实验，确定初步方案

2016.09-2017.01 对不同时期的丑柑皮进行处理，通过液相色谱法分析其中黄酮类物质的含量并检测其活性

2017.02-2017.03 查阅相关资料，进行数据处理，撰写论文

2017.03-2017.04 完成全部研究内容，提交论文准备答辩

五、主要参考文献（作者、书名、论文题目、出版社或出版号、出版年月或出版期号。文科不得少于15篇，理科不得少于10篇，其中外文文献应不少于2篇）

[1] 何大富.柑橘学[M].北京:中国农业出版社, 1999.

[2] J.B.哈本编.戴伦凯译.黄酮类化合物[M].科学出版社,1983.

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[4] 欧阳平,张高勇,康保安.类黄酮提取的基本原理、影响因素和传统方法[J].中国食品添加剂,2003,(5):54-57.

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[6] 阮伸.新橙皮苷结构的波谱分析[J].江苏化工.1994,22(3):36-40.

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[8] 管晓琳,罗刚,朱玲,等.川陈皮素诱导非小细胞肺癌A549细胞凋亡的研究[J].中国药科大学学报, 2006, 37(5):443-446.