以铁皮石斛的无菌苗作为外植体，切取茎段和花梗作为实验材料，进行圆球茎诱导研究，讨论不同浓度的TDZ和铁皮石斛的不同部位对圆球茎诱导的影响。

2、拟解决的主要问题

（1）不同激素条件对铁皮石斛圆球茎诱导效果的影响。

（2）相同激素条件下，铁皮石斛不同部位对圆球茎诱导效果的影响。

（3）不同激素条件对铁皮石斛的生长情况的影响。

三、研究方法及措施（拟采取的研究手段及技术路线、实验方案等）

（一）研究方法及手段

植物组织培养（快速繁殖）：

以铁皮石斛为外植体，选取茎段及花梗作为材料，诱导其圆球茎的生长，对其诱导率以及生长情况进行观察，研究了不同激素条件对离体培养铁皮石斛存活率、诱导率、及生长情况的影响。

（二）技术路线

铁皮石斛无菌苗→无菌苗继代扩大培养→无菌条件下截取茎、花梗作为材料→接入2种诱导培养基→观察圆球茎诱导情况、染菌情况及生长状况→圆球茎继代培养

（三）实验方案

1.1选材

本实验的实验材料选自于杭州天目山的野生铁皮石斛实验室经灭菌处理后形成的无菌苗。

1.2试验方法

1.2.1无菌系的建立

从生长旺盛的1年生铁皮石斛植株上选择生长健壮的茎段，摘去叶片和膜质叶鞘，以茎芽为中心，芽的上下各留1cm，取长约2cm的茎段，用洗洁精溶液浸泡20min，并在自来水下面冲洗30min。在超净工作台上用75%的酒精消毒30s，用无菌水冲洗3次，然后再将茎段放入0. 1%的升汞中灭菌10 min，灭菌过程中不断轻轻摇动烧杯使灭菌更加彻底，最后用无菌水冲洗5-6次，然后将茎段放在无菌滤纸上，将茎段的前后分别切去2mm，切成长约5mm左右的茎段，接种到诱导培养基上。

1.2.2培养条件

在无菌室内进行培养，培养温度( 25±1 ) ℃，全光谱日光灯照射，光照强度为1600—2000 lx，光照时数12 h·d-1。

1.2.3培养基的配置

根据不同试验阶段配置不同基本培养基，以MS或1/2MS作为基本培养基，然后根据不同培养目的添加不同浓度的激素，30g/L蔗糖和其他有机物质，培养基pH值为5.8。加7.5 g·L-1的琼脂粉。灭菌条件是121 ℃，0.105 MPa，灭菌时间为30 min。

1.3研究内容

1.3.1继代培养

为保证拥有足够的石斛植株，对生长良好的无菌苗进行继代处理。

观察到无菌石斛有大量芽体生成，转到超净台上操作，将集中生长的芽体用无菌刀片切开，分离成小株移入继代培养基中培养，透气膜封口。操作完毕放入25℃的恒温室中见光培养近2个月。

继代培养基：MS + NAA 0.1mg/L + TDZ 0.2mg/L  PH调至5.8

1.3.2圆球茎的诱导

以铁皮石斛嫩茎为外植体接种15~20天后萌动，茎段膨大，切面及顶部形成疏松组织，继续培养后膨大的组织表面形成凸凹不平的颗粒物。随着培养时间的延长，颗粒物会形成类原球茎颗粒物，再将其转入到增殖培养基中，原球茎增殖的同时也可以分化出芽点。原球茎诱导时间为30天左右，诱导出原球茎后要适时转入增殖培养基中，如果培养时间过长就会产生玻璃化现象[5-6]。

本实验将研究激素含量的不同和铁皮石斛的不同部位对圆球茎诱导效果的影响。

1.3.2.1激素含量对圆球茎诱导效果的影响

在形态发生的早期阶段，称为愈伤组织的未分化细胞团开始发育。人们通常把生长素加入到细胞培养基中以诱导细胞增殖和愈伤组织生长，人工合成生长素类物质（NAA等）和其他具有生长素或许的植物生长调节物质（2,4-D）已被广泛用于这一目的。同时，研究发现在多种植物培养体系中添加TDZ都表现出能诱导愈伤组织形成，且大大高于其他生长调节剂。例如，Cappelle等的研究表明TDZ诱导愈伤组织生成的速率是其他生长调节剂的30倍[7]。有证据表明TDZ对芽（侧芽）的萌发和不定芽产生起作用。在培养外植体的培养基里添加高浓度的细胞分裂素能促进芽的大量生成，在组织培养时极低浓度的TDZ就表现出能促进组织中心部位的生长，并且芽再生效应与其他细胞分裂素相当[8]。为了更好地促进圆球茎的形成，因此选择以不同浓度的TDZ作为变量，研究不同浓度TDZ对圆球茎诱导结果的影响。