摘  要：在标准PCR反应体系中，以芽孢杆菌SL16的基因组为模板，通过改变镁离子的浓度和加入锰离子即连续易错PCR的实验方法获得发生多个点突变的目的基因。把从大肠杆菌DH5α中提取的质粒pET-32a(+)和通过点突变获得的纤维素酶目的基因用HindⅢ和BamHⅠ分别进行双酶切后再纯化回收，用T4-DNA连接酶将其连接起来构建pET-32a-egls重组质粒。将其导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中进行转化，再将转化子接种在含氨苄青霉素的LB固体培养基上进行抗性筛选。结果表明易错PCR体系镁离子浓度为7mM，锰离子浓度为0.5mM时突变效果最好，获得的点突变目的基因电泳结果条带最亮，转化过程中接种有重组质粒表达载体的含氨苄青霉素的LB固体培养基出现许多白色菌落，表明转化成功。

关键词：点突变；易错PCR；纤维素酶；突变体库

Construction of cellulase mutagenesis library by site mutation

Abstract: In the standard PCR reaction, the genome of Bacillus sp. SL16 was used as template. The target genes of contain site mutations by changing the concentration of magnesium ion and adding manganese ion were obtained through error-prone polymerase chain reaction (EP-PCR). The plasmid that extracted from E. coli DH5α and the target gene which obtained by EP-PCR were double digested with HindⅢand BamHⅠ. After the purification of the enzyme digested PCR product, they were ligated by T4-DNA ligase. Therefore, the recombinant plasmid pET-32a-egls was constructed. Then, they were transformed into the competent cells of E. coli DH5α. Positive transformants were screened on solid LB agar containing 100ug/ml ampicillin. The results shown that in the standard PCR reaction, efficiency of site mutation is best when the concentration of magnesium ion was 7mM and the concentration of manganese ion was 0.5mM.

Key words: Site mutation; Error-prone PCR; Cellulase ; Mutagenesis library

目    录

摘要 1

Abstract 1

引言 2

1. 材料与方法 2

1.1 实验材料 2

1.1.1 实验试材 2

1.1.2 主要培养基 2

1.1.3 试剂 3

1.2 实验仪器与设备 4

1.3 实验方法 4

1.3.1 纤维素酶基因的获得 4

1.3.1.1 SL16基因组的提取 4

1.3.1.2引物的设计 5

1.3.1.3 PCR扩增 5

1.3.1.4 PCR扩增产物的纯化回收 5

1.3.2 易错PCR 6

   1.3.2.1 易错PCR模板的制备 6

1.3.2.2 易错PCR条件的优化 6

1.3.2.3 易错PCR产物的纯化回收 7

1.3.3 质粒载体的制备 7

1.3.4 易错PCR产物与质粒的双酶切 7

1.3.4.1 易错PCR产物的双酶切 8

1.3.4.2 质粒的双酶切 8

1.3.5 双酶切产物的连接 8

1.3.6 连接产物的转化 9

1.3.6.1 菌体的培养 9

1.3.6.2感受态细胞的制备 9

1.3.6.3 重组质粒的转化 10

2. 结果与分析 10

2.1纤维素酶基因的获得 10

2.1.1 SL16基因组的提取 10

2.1.2 PCR扩增 11

2.1.3 PCR扩增产物的纯化回收 11

2.2 易错PCR条件的优化 12

2.3 质粒载体的制备 12

2.4易错PCR产物与质粒的双酶切 13

3. 结论与讨论 13

参考文献 14

致谢 15

点突变构建纤维素酶突变体库

引言

纤维素是是人类非常依赖的一种可再生自然资源，在地球上数量很多，也是一种天然高分子。纤维素酶是是一种起协同作用的多组分复合酶，可以降解纤维素以及从纤维素衍生产物生成葡萄糖。根据其催化反应功能不同这一性质可将其分为内切β-葡聚糖酶，外切β-葡聚糖酶和β-葡聚糖苷酶。真菌产纤维素酶的种属多，细菌则比较少。细菌产生的纤维素酶主要是葡聚糖内切酶，最适pH一般为中性至偏碱性，大多数不能降解结晶纤维素，且产生的纤维素酶多是胞内酶或吸附在细胞壁上，不能分泌到细胞外或培养液中，难以提取。近些年来,碱性纤维素酶和中性纤维素酶在棉织品水洗整理工艺及洗涤剂工业中已成功应用,细菌纤维素酶制剂也已显示出良好的应用前景。降低以木质纤维为原料生产的生物产品以及生物能源的成本，有助于促进工业的持续发展。工业生产中主要通过减少纤维素酶的生产成本，改进纤维素酶性能和提高糖产量这三个方面来降低生物炼制的加工成本。本文就从改进纤维素酶性能这方面入手，主要通过连续易错PCR的实验方法对芽孢杆菌的产纤维素酶基因进行非定向改进获得多个点突变并构建纤维素酶突变体库，为了筛选出一株高产纤维素酶菌株。