1.材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验试材

芽孢杆菌：微生物实验室提供；

大肠杆菌：微生物实验室提供。

1.1.2 主要培养基

LB液体培养基：蒸馏水100ml，氯化钠1g，蛋白胨1g，酵母粉0.5g，混匀后倒入100ml锥形瓶中。

LB固体培养基：琼脂粉1.5g，蒸馏水100ml，蛋白胨1g，氯化钠1g，酵母粉0.5g，添加至100ml锥形瓶。

两种培养基灭菌条件：压力：0.1 MPa，温度：121 ℃，时间：30 min。

1.1.3 试剂

（1）电泳缓冲液50*TAE：100mlEDTA(0.5mol/L)，242gTris碱，冰醋酸57.1 ml，充分混匀于容量瓶中再用蒸馏水定容至1000ml，颠倒混匀。

（2）电泳缓冲液1*TAE：从上述（1）的50*TAE电泳缓冲液中取出20 ml再在1000ml蒸馏瓶中加入蒸馏水至刻度线，充分混匀备用。

   （3）1%琼脂糖凝胶的制备：称取1g琼脂糖于1000ml丝口玻璃瓶瓶中，加入100ml电泳缓冲液1*TAE，轻轻盖上盖子，在微波中持续加热2分钟，至无沉淀或絮状物出现为止，等晾至微微烫手即可倒入制胶槽中，然后等至凝固完全后取出备用。

（4）Enzymatic Lysis Buffer：2mM Na-EDTA,PH 8.0,1.2% Triton X-100 ,20mM Tris,PH 8.0,121℃灭菌处理20min加入适量的Lysozyme(溶菌酶)其终浓度为20mg/ml充分混匀后放置在-20℃的冰箱中保存。

（5）0.1M氯化钙与氯化镁混合液：称取2.03g氯化镁，1.11g氯化钙，加20ml蒸馏水充分混匀后倒入容量瓶中用水定容至100ml，摇匀备用。

（6）0.1M氯化钙：称取1.11 g无水氯化钙，加入少量蒸馏水混匀后，倒入100ml容量瓶中用蒸馏水定容，颠倒摇匀后备用。

（7）50mM氯化镁：称取0.0102g六水氯化镁于2ml离心管中，加入1ml双蒸水充分溶解，摇匀备用。

（8）500mM硫酸锰：称取一水硫酸锰0.08451g于2ml离心管中，补足1ml双蒸水，摇匀备用。

（9）5mM硫酸锰：取500mM硫酸锰溶液10ul于新的2ml离心管中，再用双蒸水补足至1ml，使其充分混匀。

（10）500mM氯化钾：称取氯化钾固体药品0.0373g于2ml离心管中，加入1ml双蒸水充分溶解，摇匀备用。

（11）100mM Tris-cl：盐酸49ml，12.11gTris碱，蒸馏水800ml，充分溶解后，滴加浓盐酸调节PH，直至PH至8.0时，倒入容量瓶中再加入蒸馏水补足至1000ml，混匀即可。

（12）细菌基因组DNA提取试剂盒（Bacteriagen DNA Kit)CW0552S，北京康为世纪生物科技有限公司。

（13）通用型DNA纯化回收试剂盒(Universal DNA Purification Kit）CW0519，北京康为世纪生物科技有限公司。

（14）Hipure Plasmid Mini Kit质粒提取试剂盒，深圳市汉普生物科技有限公司。