本研究通过EMS诱变得到一个近轴面白化突变体wad1,利用了图位克隆的方法分离了WAD1基因通过对突变体农艺性状观察、叶片叶绿素含量测定、甲苯胺蓝染色观察叶绿体分布情况以及叶绿体发育相关基因的表达分析探究该基因的生物学功能。该研究有助于我们进一步了解叶绿体发育的分子机理，为培育高产稳产的水稻品种提供理论支持。

第一章 材料与方法

1.1 实验材料

本研究使用的水稻材料为蜀恢（野生型，SH）、水稻近轴面白化突变体wad1。其中，wad1是水稻品种SH经EMS诱变处理获得，经连续多代自交，突变性状遗传稳定的水稻突变体。

参试水稻品种种子浸种后在30℃恒温箱中发芽，3-4d后将发芽的水稻种子播种于人工气候室中，水培培养，培养液（营养液配方见表1.1）每3d 更新1次。人工气候室培养件为：恒温30℃，光照及黑暗时间为14h/10h，光照强度为20000Lux。

表 1.1水稻水培营养液的配方组分 成分 终体积

注：每隔三天需要更换培养液，营养液的pH=5.5-6.0

1.2实验方法

1.2.1 wad1突变体表型观察

随机选取发育较好水培野生型和突变体幼苗（6天）以及40天的大田条件下野生型和突变体幼苗种在含泥土的盆栽中，在黑暗的背景下，拍照对比叶片之间的表型变化。

1.2.2叶绿素含量的测定

实验采用乙醇丙酮混合提取法测量水稻叶片中叶绿素的含量。选取相同部位且正常生长的近轴面白化突变体wad1和野生型的叶片0.05g，剪成约2mm左右的小块，放入含有20ml提取液的具塞的玻璃试管中，在黑暗的条件下常温放置24小时，为了充分提取叶绿素，每隔一段时间轻微摇晃玻璃试管约2-3次。提取液由丙酮，乙醇和水，按照4.5:4.5：1的比例混合配制而成。用分光光度计测量混合提取液在663nm和645nm波长处的吸光值，每个样品重复测三次，每组样设置3个平行对照，求平均值，根据下列公式计算叶绿素含量。计算公式如下：

叶绿素a的含量=（12.7A663-2.59A645）×0.4

叶绿素b的含量=（22.9A645-4.67A663）×0.4

总叶绿素的含量=叶绿素a的含量+叶绿素b的含量

式中叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素的含量，单位为mg/g；