植物根际微生物指存在于植物根际并能直接或间接地促进或调节植物生长的一类微生物[7]。目前，对作为生物菌肥主要成分的解钾菌、解磷菌、固氮菌研究较多。解磷菌可溶解无效性磷，转变成植物能利用的磷素，其分泌的多糖物质，可使土壤团粒构造变好，增加土壤的优良物理特性[7]。解钾菌可以分解矿物态钾，促进难溶性的钾元素转化成可溶性成分[8]。因此，本实验通分离筛选解钾解磷菌，为高效生物肥料的研发提供菌种资源和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 土样的采集

采用五点取样法采集小麦根际土壤，用无菌塑料袋包好，在塑料袋外贴上标签，注明采样地、采样时间等，放置冰箱备用。

1.1.2 分离培养基

    解磷菌分离及筛选培养基[9]：葡萄糖10g，（NH4)SO4 0.5g，KCl 0.3g, MgSO4·7H2O 0.3g，Ca3(PO4)210g,  FeSO4·7H2O 0.03g ， MnSO4·4H2O 0.03g， 水1000mL，  琼脂20g ，pH值7.0~7.5

    解钾菌分离及筛选培养基：蔗糖5g，  Na3HPO4 2g， MgSO4·7H2O 0.5mg， FeCl3  5mg，  CaCO3  0.1g ， 钾长石粉 10g， 水1000mL， 琼脂 20g， pH值7.0~7.5。

     牛肉膏蛋白胨培养基[10]：牛肉膏 3g ， 蛋白胨 5g， 琼脂 18~20g，  水 1000mL， pH 7.0~7.2

     (在实验过程中所配制的培养基都在高压蒸汽灭菌锅中在121℃下灭菌20分钟，所有玻璃器皿都在干热灭菌箱中160℃灭菌2小时）

1.1.3 主要仪器

超净工作台                         上海博讯实业有限公司医疗设备厂

电磁炉                             北京中兴伟业仪器有限公司

高压蒸汽灭菌锅                     上海申安医疗器械厂

微波炉                             广东美的厨房电器制造公司

超凡型小容量恒温培养摇床           上海世平设备有限公司

电热恒温培养箱                     上海一恒科学仪器有限公司    

显微镜                             上海比目仪有限公司

1.2 方法

1.2.1 解钾菌与解磷菌的分离筛选

称量10g土壤分别加入解钾菌、解磷菌富集培养基，28℃，150r/min震荡富集培养48h，用移液枪分别抽取0.1mL富集培养液加入9mL的无菌水试管种，制成10-3. , 10-4, 10-5 的菌悬液，涂布在解钾菌、解磷菌筛选培养基上，每个浓度涂布3个培养皿，然后在28℃恒温培养箱中培养5天，挑取菌落形态不同菌株在培养基上进行分离，通过观察平板上所长菌落的透明圈初步筛选出高效解钾菌和解磷菌。挑取具有透明圈的单菌落纯化几次，然后挑取菌落到牛肉膏蛋白胨培养基中进行扩大培养[11]。并对菌株编号，解钾菌A1-6，解磷菌B1-6。

1.2.2 菌落形态观察

挑取牛肉膏蛋白胨培养基中的菌落与解钾、解磷菌的培养基中进行恒温培养，观察其细菌生长情况以及菌落特征。

1.2.3 菌株形态学鉴定

对解钾菌A2、A6，解磷菌B1，B4进行革兰氏染色、芽孢染色、荚膜染色[10]、在显微镜下观察其菌体形态。

1.2.4 菌株的生理生化鉴定

以筛选培养基为基础培养基，参照微生物学试验，对解钾菌A2、A6.解磷菌B1，B4进行生理生化鉴定。

吲哚产生试验[12]：用1%胰蛋白胨水溶液，pH7.0~7.2，每支试管装5毫升灭菌，接种细菌，25℃培养10天。测定时用浸在饱和草酸溶液中的滤纸条，待完全干燥后，夹在培养好的管壁和棉塞之间，滤纸勿接触液面。若滤纸呈淡红色则说明有吲哚产生，为阳性反应。