摘要：目的：研究底物、糖基供体和酶对莱鲍迪苷A(RA)生物合成的影响，探讨影响RA生物合成的关键因素，初步探明RA生物合成途径，为进一步提高甜叶菊中RA含量的分子育种工作提供依据。方法：分别在全酶、硫酸铵沉淀蛋白和UGT76g1两种类型酶蛋白催下，以STV、RB和RC为底物，以UDPG或ADPG为供体，高效液相分析，检测RA、STV和RC等化合物的含量变化情况。结论： RA生物合成途径的底物是STV，糖基供体对此促进效果比较弱，且该反应是可逆反应，两种UGT76g1酶蛋白都会促使RA分解生成STV；RB和RC在一定的酶蛋白和糖基供体条件下可生转化为RA和STV。

关键词：甜叶菊；莱鲍迪苷A；UGT76g1；糖基供体

Research on Biosynthetic Pathway of Rebaudioside A

Abstract：Object ：To study the effect of substrate, glycosyl donor and enzyme on the biosynthetic pathway of rebaudioside A,ascertain the key factors in the rebaudioside A biosynthetic pathway, preliminarily establish biosynthesis pathway of rebaudioside A, improving the content of rebaudioside A in Stevia. Method：Under different enzyme conditions,using stevioside, rebaudioside B and rebaudioside C as substrates ,then added ADP-glucose and UDP-glucose respectively , measured the peak area of rebaudioside A、stevioside and rebaudioside C by HPLC. Conclusion：The results show that the substrate of the rebaudioside A biosynthetic pathway is stevioside and the effect of sugar donor is weak, and this reaction is a reversible reaction. However two kinds enzyme of UGT76g1 can promote the conversion of rebaudioside A into stevioside, and this reaction is a reversible reaction; rebaudioside B and rebaudioside C can be converted to rebaudioside A and stevioside under the conditions of a certain enzyme and sugar donor.

Key words: stevia；rebaudioside A；UGT76g1； glycosyl donor

目录

摘要 4

关键词 4

Abstract 4

Key words 4

1  仪器与试剂 5

1．1  仪器 5

1．2  试剂 5

1．3  材料 5

2  实验方法和结果 5

2．1  实验方法 5

2．1．1 色谱条件 5

2．1．2 标准品溶液的制备 5

2．1．3探究干粉和新鲜叶子在全酶条件下与RA生物合成途径相关的底物和糖基供体 5

2．1．4 探究干粉和新鲜叶子在硫酸铵沉淀法处理条件下与RA生物合成途径相关的底物和糖基供体 5

2．1．5 探究UGT76g1单酶条件下与RA生物合成途径相关的底物和糖基供体 5

2．1．6 稳定性试验 6

2．1．7 重复性试验 6

2．2  结果与分析 6

2．2．1 全酶条件下使用不同酶来源的结果比较 6

2．2．2 硫酸铵沉淀法处理不同酶来源的结果比较 7

2．2．3 UGT76g1野生型和突变型酶蛋白实验组的结果比较 9

3  讨论 12

致谢 13

参考文献： 13

图1 全酶条件下以STV为底物反应测得的RA和STV含量比较.....6

图2全酶条件下以RB为底物反应测得的RA和STV含量比较.....7

图3全酶条件下以RC为底物反应测得的RA、STV和RC含量比较....7

图4硫酸铵沉淀法以STV为底物反应测得的RA和STV含量比较....8

图5硫酸铵沉淀法以RB为底物反应测得的RA和STV含量比较......8

图6硫酸铵沉淀法以RC为底物反应测得的RA、STV和RC含量比较....9

图7底物对RA、STV和RC含量影响比较.....9

图8野生型酶蛋白对RA、STV和RC含量影响比较......10

图9突变型酶蛋白对RA、STV和RC含量影响比较......10

图10 UGT76g1酶蛋白条件以STV为底物反应测得的RA和STV含量比较....11

图11 UGT76g1酶蛋白条件以RB为底物反应测得的RA和STV含量比较.11

图12 UGT76g1酶蛋白条件以RC为底物反应测得的RA和STV含量比较.12

甜叶菊莱鲍迪苷A生物合成途径解析

甜菊糖苷是从美洲南部一个小国家生产的一种菊科小灌木甜叶菊 (Stevia rebaudiana bertoni)叶子中提取得到的一种非常好的纯天然甜味剂，因为其甜度非常可观比蔗糖要高300~400倍，但是热量连蔗糖的1/300都不到[1]，迄今为止，科学家们从甜叶菊中分离提纯的糖苷高达8种，其中最出色的莫过于不仅蕴含最高甜度和最纯味道品质，而且还拥有很明确的结构和对人体健康无威胁的RA（莱鲍迪苷 A ， Rebaudioside A），只要经过简单纯化的处理就可以排除那些影响口感的不被需要的糖苷，所以RA作为一种拥有着天然、对人体无害和可以从植物提取等不可忽视优点的甜味剂已经顺利进入西方市场。进入中国并且经过了四十几年的发展，我国早就成为甜叶菊生产的最主要的区域。为了我国甜菊糖产业的健康发展,提高甜菊糖苷产品的国际竞争力,有必要对RA的生物合成途径及其合成方法等方面进行研究。