以前因为甜菊糖针对人体毒理性质和代谢方式的研究很少，使得其食用是否安全存在很大的争议，大约二十年前A. G. Lyakhovkin 和 M. Matsui 等设计了相关实验证实了RA对人体不存在毒性，且不会在人体环境内受到诱导发生变异[4-5]；K. C. Maki等[6]通过实验验证莱鲍迪苷A并不会打破糖尿病人血液中糖代谢平衡也不会使其血压发生明显变化[7]；刘杰等[8]设计了紧急性毒理毒害方面实验，通过观测小鼠的血糖变化值确认莱鲍迪苷A不会使其血糖发生变化；还有很多针对莱鲍迪苷A安全性的实验报道确认了其对人体健康是没有影响的，糖尿病病人也可以遵照医嘱放心使用。

但目前对于RA 的生物合成途径仍未有定论，且中国作为甜菊糖苷产业最大的生产国和出口国，对于高纯度的RA的需求非常大，并且它原料广泛，存在有开发的可能性。因此为了改变这种现状，有必要开展相关研究。通过探索RA的合成通路，确定RA合成过程的底物与糖基供体种类，提出RA的生物合成途径的猜想，提高甜叶菊中RA含量，为消费者提供替代蔗糖的天然优质甜味剂。为此，本毕业实验利用高效液相色谱法在以甜叶菊干粉和新鲜叶子作为反应原料的RA含量情况进行分析的基础上，为RA生物合成途径的确定提供依据。

1  仪器与试剂

1．1  仪器

Waters 1515高效液相色谱仪、Waters 2487 PDA紫外可见光检测器、Breeze色谱工作站。Eppendorf Centrifuge5417R离心机、JA2003B型电子天平（上海越平科学仪器有限公司)、水浴锅、实验室玻璃仪器。

1．2  试剂

乙腈为色谱纯;水为超纯水；UDPG、ADPG(上海源叶生物科技有限公司）；MgCl2、硫酸铵、正丁醇、K2HPO4 、KH2PO4 为分析纯。

1．3  材料

本实验所用干粉和新鲜叶子材料均从位于南京浦口的江浦农场甜叶菊育苗基地采集，经鉴定确定为菊科植物甜叶菊（ S. rebaudiana ）。

2  实验方法和结果

2．1  实验方法

2．1．1 色谱条件

色谱柱:Amethyst C18柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)；流动相为乙腈:水(体积比30∶ 70)；检测波长:210 nm；柱温:25℃；进样量:15 μL；流速:0.8mL/min。

2．1．2 标准品溶液的制备    

准确称取STV、RA、RB、RC标准品10mg，置2mL离心管中，用1mL蒸馏水溶解配制成STV、RA、RB、RC饱和标准品溶液，备用。

2．1．3探究干粉和新鲜叶子在全酶条件下与RA生物合成途径相关的底物和糖基供体

取甜叶菊干粉或者新鲜叶子和0.1mol·L-1 K-P溶液于冰上研磨，后加入超纯水匀浆，取12ml在离心机中以1000rpm、4℃ 离心10min，取50μl上清溶液，后加入200μl的反应buffer。反应buffer由100μl 100mMK-P pH7.0、10μl 0.1molUDP-Glc或0.1molADP-Glc、10μl 60mmol.L -1MgCl2、27μl STV饱和液、RB饱和液或RC饱和液和53μl超纯水组成，90min后（实验组）加入400μl水饱和正丁醇停止反应，混匀3次放到离心机中以1000rpm、20℃离心20min，后用高效液相色谱法测定RA、STV、RC含量。

2．1．4 探究干粉和新鲜叶子在硫酸铵沉淀法处理条件下与RA生物合成途径相关的底物和糖基供体

参照2.1.3步骤，将上清溶液用硫酸铵沉淀法100%沉淀3次后，再溶解取50μl溶液进行后续实验。