本实验引物设计基于内参基因的全序列扫描变异情况。通过选择3’端保守序列,且变异度<10%的片段来作为设计片段,再通过软件设计合适的引物。
摘要:参考基因作为基因表达水平标准化分析的参照指标,被广泛用于基因表达地标准化分析中。持家基因常作为内参基因使用,而近来实验证明,常用的持家基因在不同环境条件下的表达水平存在差异,盲目使用持家基因作为内参基因会导致错误。本实验要找到一个或几个可用于甜叶菊转录水平分析的参考基因及其引物。利用基因全序列碱基变异情况扫描确定合适的引物并检测其可用性,借助荧光定量PCR和geNrom、NormFinder、BestKeeper三个程序的数据分析,从8个候选内参基因中筛选出了在不同样品中表达较为稳定的Unigene0012701基因,作为甜叶菊转录组数据分析用的内参基因。
关键词:内参基因;甜叶菊;荧光定量PCR
Identification and Validation of Potential Reference Genes for qRT-PCR in Stevia
Abstract:Reference genes,which serve as endogenous controls to ensure that the gene expression analysis are accurate and reproducible, are vital for data normalization. Usually, housekeeping control genes are referred to reference genes. However, these reference genes limited to particular experimental conditions and designs. The use of reference genes whose normalization has not been validated will lead to erroneous gene expression profiles for the target gene.Therefore, it is necessary to evaluate potential reference genes under different experimental conditions.The reverse transcription quantitative PCR is a widely used technique for the measurement of gene expression.In this study, we were intended to find one or more suitable reference genes to analyses the gene expression in Stevia,which is one of the natural sweeteners.To bolster the literature on reference gene selection in Stevia,quantitative reverse transcription-PCR were use to validate the primers which is based on the scanning of full gene sequence. And with the help of software like geNrom, NormFinder, BestKeeper, one of the potential reference genes ,Unigene0012701, is selected as the most suitable reference genes in various samples .And then, the developed primers for the novel references genes will enable better normalization and quantification of transcript levels in Stevia in the future.
Key words: reference genes;Stevia;quantitative reverse transcription-PCR
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words: 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 植物材料 2
1.2 总RNA的提取 2
1.3 cDNA的合成 2
1.4 候选内参基因的确定及引物设计 3
1.4.1 候选内参基因的确定 3
1.4.2 引物设计 3
1.4.3 引物筛选 3
1.5 荧光定量PCR 4
1.6 统计分析 4
2 结果与分析 4
2.1 引物特异性和扩增效率 4
2.2 内参基因的筛选 5
2.2.1 候选内参基因的Ct值分析 5
2.2.2 geNorm分析 6
2.2.3 NormFinder分析 7
2.2.4 BestKeeper分析 8
3 讨论 8
致谢 9
参考文献 9
甜叶菊内参基因的筛选
转录组数据分析以能够稳定表达的基因作为重要的参考。特别是在定量PCR的研究中,为了尽可能去除不同标本在RNA的产量、质量以及逆转录效率上存在的差别来获得目标基因特异性表达的真正差异,一般选择一定的内参基因来进行校正和标准化。内参基因即内部参考基因,理想的内参基因需要有有适中的表达水平,并且在不同的组织、不同发育时期、不同的实验处理条件下没有明显的表达水平上的差异[1],从而可以在检测基因表达水平的变化时作为标准参照物。其中,最为广泛使用的包括18s rRNA,GAPDH,EF-1α(转录延伸因子),UBQ(泛素)和ACT(肌动蛋白)等内参基因;这些基因通常被称作持家基因,在细胞结构维护或者基础代谢中扮演着重要角色。近来,越来越多的实验表明,部分持家基因在受到多种实验条件处理的时候表达量会呈现一定的不稳定性[2],影响其在基因表达研究中的应用。目前在没有更好的选择时,许多研究者选择忽视所分析的材料的生理发育状态,仍旧依赖其中的一两个基因进行实验。