Unigene0022705 26s proteaspme subunit P45

Unigene0000562 PeptidaseC19,ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase

Unigene0017771 Peptidase C19,ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 2

Unigene0038816 Ysc84 actin-binding damain-containing protein

Unigene0021928 Translation elongation factor EFTs/EF1B

Unigene0012701 Site-containing protein

Unigene0008575 Ubiquitin fusion UFD1,partial

1．4．2 引物设计

本研究中，通过对候选内参基因的基因全序列碱基变异情况扫描来确定合适的引物设计位点，使用在线引物设计程序Primer3.0来设计荧光定量PCR的引物。引物设计采用以下原则，选择靠近3’端的保守序列且变异度小于10％的区段来设计，GC含量在40％到60％，扩增产物大小在50-200bp不超过300bp。设计结果如下，其中Tm值为引物合成单上给出的Tm值，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

  表2  引物设计结果

Tabel 2 Prime design

Gene ID Primer sequence(5’ to 3’) Tm(℃) 产物大小（bp）

Unigene0025140 F GTAACCTTCGCGTTGCATTT 53.44 244

R CGGGCTTCAGTTTCATTGTC 53.13

Unigene0022705 F CCTTCCTTTGATCGGAAACA 51.32 233

R ACTCCACCCACTGATTCACC 54.87

Unigene0000562 F GTCAGCACTGGCTTGTTGAA 51.35 184

R CAATTGCCATCCCATTCTCT 53.62

Unigene0017771 F GCATGTTCGTTGAGCTACCA 54.27 240

R CCGATGGAATGGATATGAGG 50.82

Unigene0038816 F GTGGCTCGAAGAGAAGATGG 51.66 194

R ACCGGCTCCAAGAGAAAAAT 51.33

Unigene0021928 F AGCAATACGTCCCAAACCAG 53.83 164

R AATTGAGCGGTGAAACAACC 52.91

Unigene0012701 F TGCTTTCCATCTGCTCTCTTT 53.41 109

R CGAGCCGTAGCTTCATACTTAGAC 57.44

Unigene0008575 F GTAACAACCCACCACCTGCT 55.76 221

R CGAGTATTTCTTCCCCGTGA 52.73

1．4．3 引物筛选

用康为世纪生物公司的新型植物基因组DNA提取试剂盒（CW0531S）提取甜叶菊的DNA，用合成的8对引物分别进行常规PCR，反应体系如下表3所示。PCR扩增程序设定：94℃预变性3min，94℃变性30s，52.5℃退火30s，72℃延伸20s，共36个循环，最后72℃延伸10min,4℃保存。制备琼脂糖（3％）凝胶进行电泳，用凝胶成像系统拍照保存。

以反转录得到的cDNA为模板，用合成的8对引物分别进行常规PCR，反应体系如下表4所示。PCR扩增程序设定：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸25s，共35个循环，最后72℃复性7min,4℃保存。制备琼脂糖（3％）凝胶进行电泳，用凝胶成像系统拍照保存。

以反转录得到的cDNA为模板，依次稀释5个梯度，每个梯度稀释10倍。根据qRT-PCR结果，把初始模板的log值作为横坐标，将结果得到的Ct值作为纵坐标绘制标准曲线，并计算扩增效率。从而筛选出扩增效率合格且特异性良好的引物用于后续实验。