早期关于内参基因的实验中，目标基因的表达水平分析往往依赖于某一个内参基因。然而现在研究表明，单内参基因并不是最佳选择，在qRT-PCR实验里选择两个或两个以上的内参基因可获得更为可靠的结果[3]。为了从候选内参基因中筛选出最合适的内参基因，一些分析软件如geNorm[4],NormFinder[5]和BestKeeper[6]等被开发出来用于数据分析。这些软件大体相似，是基于Excel的加载宏，但他们的算法各不相同。例如，geNorm进行成对的比较，求出一系列实验样品和内参基因的几何平均数来筛选出最适用于给定样品的内参基因,即在各个样本中表达量差异较小的参考基因；geNorm不仅提供内参基因的稳定性排名，还指出了合适的内参基因数目。

甜叶菊Stevia rebaudiana (Bertoni) Hemsl,菊科甜菊属的多年生草本植物，原产巴拉圭，叶片中已知含有三十多种甜菊糖苷的成分，包括高甜度低热量的RA（莱鲍迪甘A，Rebarudioside A)和STV（Steviolside),其甜度几乎是蔗糖的150~300倍[7]，是极好的天然甜味剂。本实验以甜叶菊转录组数据分析用内参基因的筛选为最终目的，从上海博豪生物测序的基因中筛选出8个较为合理的基因作为候选内参基因，利用qRT-PCR对同一品种甜叶菊的四个不同部位不同生长时期的样品（分别为材料靠顶部的新叶、老叶，靠底部的老叶，茎秆）作表达量的分析，并利用geNorm,NormFinder和BestKeeper3款不同的软件筛选出合适的内参基因用于甜叶菊的转录组数据分析。

1  材料与方法

1．1  植物材料

本实验所用植物材料均为南京农业大学罗庆云课题组所选育的甜叶菊。取同一株材料的上部老叶、嫩叶，下部老叶，茎秆四个部位进行实验。

1. 2  总RNA的提取

实验采用试剂盒法提取甜叶菊样品的总RNA，所用产品为生工生物工程（上海）股份有限公司的柱式植物总RNA抽提纯化试剂盒，该试剂盒专门针对次生代谢物质如多酚、多糖在细胞裂解后与RNA紧密结合形成难溶物或沉淀的难题而研发，适用于各种植物样品的RNA快速提取，操作方便。实验所用的研钵、研杵、容量瓶均用锡纸包住后在烘箱180℃高温中烘烤8h；1.5mL离心管和枪头在0.1％的DEPC水中浸泡过夜，120℃高压灭菌30min方才使用。抽提方法如下：

1）取450μLBuffer Rlysis-PG加入至1.5ml的离心管中以备用。

2）取20-25mg植物组织并且用液氮研磨成粉末，并加入到上述1.5mL离心管中，立即振荡混匀，室温放置5min。

3）12000rpm4℃离心3min,将上清液移至1.5mL离心管中。

4）加入1/2体积无水乙醇，充分混匀。

5）将吸附柱放入收集管中，用移液器将溶液全部加至吸附柱中，静置1min，室温1200rpm离心1min,倒掉收集管中废液。

6）将吸附柱放回收集管中，加入500μL GT Solution，静置1min,室温1200rpm离心1min,倒掉收集管中废液。

7）将吸附柱放回收集管中，加入500μL NT Solution，静置1min,室温1200rpm离心1min,倒掉收集管中废液。

8）将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心2min。

9）将吸附柱放入1.5mL的离心管中，在吸附膜中央加入30-50μL DEPC-treated ddH2O，静置2min,12000rpm离心2min，将所得到的RNA溶液置于-70℃保存。

1. 3  cDNA的合成

cDNA第一链的合成使用TaKaRa的Prime Script II 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒，反应体系和步骤按照说明书进行。

1．4  候选内参基因的确定及引物设计

1．4．1 候选内参基因的确定

从由上海博豪生物技术有限公司测序的基因中筛选出了8个候选内参基因。

表1  候选内参基因

Table 1 Candidate reference genes

Gene ID Gene description

Unigene0025140 Cytochrome c domain-containing protein