在先前的研究中，已使用干旱处理的未授粉的玉米丝和玉米穗构建抑制差减杂交（SSH）文库（Li等人，2007）。结果发现未表达序列标签（EST）组与水稻和拟南芥的ERD4基因具有高度序列相似性。在本研究中，完成了玉米ZmERD4基因的克隆和功能分析

材料和方法：

植物材料和胁迫处理

使用耐旱玉米近交系“CN165”。将植株培养在直径30cm，深50cm的盆中，每盆含有20kg土壤混合物（土壤 - 蛭石 - 有机肥= 3：2：1）并一直放置在遮雨棚下。在对植物进行胁迫处理之前，每隔一天向每个盆施加等体积的水以使所有盆中的植物保持在一致的水状态条件下。对两周大的幼苗进行盐（100mM NaCl），冷（4℃）或ABA（100μM）胁迫。在每个给定时间点收集五个幼苗并立即冷冻于液氮中。通过不浇水使土壤湿度达到30-35％施加缓慢的土壤干旱胁迫。在实验开始后的第1,2,3,4,5和7天，每天收集5个幼苗并立即在液氮中冷冻。没有胁迫的对照组平行生长并在一致的时间点收集样本。这些收集来的组织样本用于RNA提取，将其放在-70℃下储存备用。

ZmERD4全长cDNA的分离

从先前构建的SSH文库（Li等人，2007）中获得长度为426 bp的表达标签序列，此序列与水稻（粳稻品种组，XP_476646）ERD4为同源基因，再根据此序列设计用于快速扩增cDNA末端的引物。使用Invitrogen Trizol试剂盒（Invitrogen，San Diego，CA，USA）从六个时间点收集的未授粉的玉米穗和玉米丝中提取总RNA，并均等地膨化。使用Oilgotex法分离Poly (A) RNA。

使用SMARTTM RACE cDNA扩增试剂盒（Clontech，Palo Alto，USA）合成5'-和3'-RACE的cDNA模板。5'-和3'-RACE的引物序列如下：ZmERD4-R1,5'-GGCTGGAAG CAGGGGCACGAGAAC-3'，和ZmERD4-F1,5'-GGTGTCGCATACTTTGCCCTCGGA-3'。还设计了特异性嵌套的5'-RACE引物：ZmERD4-R-N：5'-AAGCAGGGGCACGAGAACGGACGC-3'。每个样品扩增的RACE片段都测序三次。

基于5'-RACE和3'-RACE结果，ZmERD4的全长引物设计如下（包括起始和终止密码子）：ZmERD4-F2,5'-AAACGAACAGCACCAGAACC-3'和ZmERD4-R2,5'-CC ATCAGAAATCCCACACGAAT-3'。

基于5'-RACE和3'-RACE结果，ZmERD4的全长引物设计如下（包括起始和终止密码子）：ZmERD4-F2,5'-AAACGAACAGCACCAGAACC-3'和ZmERD4-R2,5'-CC ATCAGAAATCCCACACGAA -3'。ZmERD4全长cDNA的扩增和测序通过进行三次重复实验而重复。

RNA凝胶印迹分析和RT-PCR

根据说明书使用Trizol试剂在不同的发育阶段和不同的应激处理条件下从不同组织中提取总RNA。在用甲醛变性的1.0％琼脂糖凝胶上分离总RNA（20μg）。电泳后，将凝胶印迹到带正电的尼龙膜（Amersham，Little Chalfont，UK）上。将使用32P-dCTP标记的ZmERD4 3'-非翻译区（UTR）用作探针。进行Northern印迹杂交，并使用Molecular Imager FX 系统（Bio-Rad，CA，USA）捕获信号。

使用以下两个ZmERD4特异性引物进行半定量RT-PCR：ZmERD4-F3：5'-TCCTCTGTGCTGTCCATCTTG-3'和ZmERD4-R3：5'-GCCTTGTGCCCTCAGTATTAC-3'。在一步RT-PCR试剂盒（Takara，Tokyo，Japan）中将1.0-μg总RNA模板用于PCR反应混合物中。用作对照的玉米肌动蛋白基因，使用以下引物：肌动蛋白-F1,5'-GCATCA CACCTTCTACAACGA-3'和肌动蛋白-R1,5'-CAGCCTG GATAGCAACATACAT-3'。PCR条件如下：95℃下3分钟，94℃30秒，58℃30秒，72℃90秒，此三个步骤进行28个循环，最终延伸步骤72℃下5分钟。

转ZmERD4基因拟南芥的构建和转化

ZmERD4全长cDNA经NcoI和BstEII酶切后，连接到已被修饰的pCAMBIA-3301克隆载体的相应位点，并由花椰菜花叶病毒（CaMV）的35S启动子驱动。将融合基因ho构建载体转入到农杆菌GV3101菌株中。

使用花浸法（Clough and Bent 1998）进行拟南芥的转化。收获种子并置于含有草丁膦（0.05％）的选择培养基上以分离鉴定转基因植物。通过PCR分析证实转基因的存在。通过RNA凝胶印迹检测ZmERD4的信使RNA（mRNA）水平。通过自交获得纯合T4系并用于应激处理实验。