野生型和转基因拟南芥的干旱和盐胁迫处理

干旱胁迫组处理如下：转基因植物和对照植物在恒定浇水情况下生长4周，然后不浇水。停止浇水15天，此后每日为植物定值浇水。5天后对所有存活的植株进行评分。在该测定中使用8盆（每盆中有4株植物）转基因拟南芥并重复此实验三次。

盐胁迫组处理如下：对于盐胁迫，将转基因和对照种子播种在含有MS培养基的培养皿中，所述培养基补充有不同的NaCl浓度，包括0mM,75mM和100mM。在每次NaCl处理中使用五个培养皿，并且在每个皿上播种约30个种子。将培养皿在4℃温育2至3天以确保均匀发芽，然后在22℃温育。7天后对种子萌发百分比进行评分。

上述所有实验重复三次。

ZmERD4基因的生物信息学分析

对ZmERD4的全长cDNA进行BLASTn和BLASTx分析。使用DNAMAN软件（版本5.0，www.lynnon.com）推导出氨基酸序列。ClustalW用于氨基酸序列比对（http://www.ch.embnet.org/software/ ClustalW.html）。使用以下网站进行ZmERD4蛋白质结构的预测：http：//www。expasy.org。使用TMHMM Server v.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM /）和SOSUI engine v.1.11软件（http：//bp.nuap.nagoya-u.ac。）进行跨膜预测。JP/SOSUI/sosui_submit.html）。

结论：

ZmERD4的分子克隆和组织特异性表达分析

使用RACE，获得长度为2,536bp的全长ZmERD4序列（GenBank登录号EU348754）。 ZmERD4基因由2,196bp的开放阅读框（ORF），48bp的5'-UTR和292bp的3'-UTR组成。预测ORF编码长度为732个氨基酸的多肽。推断出ZmERD4所编码的氨基酸与其他植物的ERD4具有序列相似性如下：与水稻的OsERD4有81％序列相似性（BAC82906），与拟南芥的NPER4有56％序列相似性（NP_564354），以及芸薹ERD4有56％的序列相似性（ABV89652）。基于RT-PCR分析，根，茎，叶，丝和穗中ZmERD4的mRNA水平相似（图1），因此表明该基因在转录水平上持续表达。

图 1RT-PCR检测ZmERD4的表达。从不同组织中提取RNA并用于RT-PCR。通过400bp产物的PCR扩增检测ZmERD4 mRNA的存在。R，ST，L，SI和E分别对应于从根，茎，叶，丝和穗组织分离的mRNA。使用特异性引物将来自玉米的肌动蛋白扩增为内部对照ZmERD4对不同非生物胁迫及ABA处理的反应在干旱胁迫后1天诱导玉米叶中ZmERD4的转录物，并在干旱处理后第二天达到最高水平（图2a）。然而，冷（4℃）处理后转录水平没有显着差异，表明ZmERD4在低温胁迫下未被诱导（图2b）。ZmERD4也对高ABA和盐处理有反应，并且分别在处理后3和6小时检测到最高水平的转录物（图2c，d）。这些数据表明ZmERD4是一个胁迫相关基因，可能参与植物对环境胁迫的适应。

图 2不同胁迫处理下玉米幼苗中ZmERD4的表达。a:7天的干旱处理。b:在4°C下冷处理24小时。c:用100μMABA处理24小时。d:用100mM NaCl处理24小时。同时，用32p标记的ZmERD4 cDNA探针对总RNA进行杂交。用溴化乙锭染色的rRNA显示为上样对照转ZmERD4基因拟南芥植株的表型和表达分析通过实验产生了30多个独立的转基因品系；通过PCR分析证实了转ZmERD4基因成功（图3a）。在正常生长条件下的T4转基因系中通过Northern印迹分析进一步检测ZmERD4的转录水平（图3b）。选择ZmERD4 mRNA表达量高的转基因系4,13,24和25用于进一步分析。

在正常生长条件下，与野生型对照植物相比，构成过表达ZmERD4的转基因株系表现出轻微的生长迟缓（图3c）。

图 3过表达ZmERD4的转基因拟南芥植物的分子表征和表型。 a:使用从对照植物（1和2）和转基因品系（3至15）分离的基因组DNA通过PCR检测ZmERD4转基因。分子标记显示在左侧。b:在正常条件下生长的4周龄野生型和独立35S :: ZmERD4转基因系的mRNA表达水平。c:正常生长条件下3周龄野生型和ZmERD4过表达株系的形态学比较ZmERD4在拟南芥中过量表达增强的抗旱和耐盐性缺水15天而遭受干旱胁迫的所有野生型（对照）植物萎蔫；然而，大多数转基因植物继续正常生长（图4a）。在复浇水5天后，大多数对照植物无法恢复健康形态并最终死亡，而大多数转基因品系仍健康生长（图4b）。与严重水分胁迫条件下的野生型植物（存活率44.44％）相比，大约80-90％的转基因植物连续存活并继续生长（图4b）。