在10ml的甲醇溶液中溶解10mg 13C3---AM标准单体原液一份,储存在零下20度温度下。同样温度下,储存一份原液II号,此溶液从99ml的甲醇溶液中溶解1ml13C3—AM标
在10ml的甲醇溶液中溶解10mg 13C3---AM标准单体原液一份,储存在零下20度温度下。同样温度下,储存一份原液II号,此溶液从99ml的甲醇溶液中溶解1ml13C3—AM标准溶液I号而得。再从99ml的0.1%甲醇溶液中溶解1.00ml原液II号,一样的温度下储存。
两克的PAHG样本浸泡在带有13C3-AM的纯净水中(10ml),在400rpm下,振荡30min,分离10min,然后保留上层清液。
上层清液和8g硫酸铵混合,在4000rpm下振荡且分离10min.10g的上层清液保留继续使用。10g的无水硫酸钠和2g的硅藻土放入一个干净点的玻璃层析柱中。然后,5g的硅藻土和样本上清液原液混合放入层析柱中,在60ml的乙烷里以2ml/L的速率进行洗脱,在60ml的乙酸乙酯里同样以2ml/L的速率进行再次洗脱。乙酸乙酯的洗提物搜集起来,在45度的水浴中汽化3次。之后,样本原液和1ml的0.1%甲酸进行混合和振荡。1ml的乙烷加入后,它在5min 3500rpm下进行振荡和分离。在底层水相中用0.23um滤膜过滤,然后用HPLC—MS进行测量。
样本溶液和标准溶液被注入HPLC—MS/MS系统中,AM和13C3—AM的峰面积会被记录,并计算AM和13C3—AM的峰面积速率。标准溶液的样本数量变化以及AM和13C3—AM的峰面积绘制在直线图中。
样本中的AM含量通过以下公式计算:Xn=
在以上公式中,Ms 表示13C3—AM的样本含量。An是目标峰面积,As是13C3—AM速率峰面积,M是样本容量。相对反应因子通过以下因素计算:
An是目标峰面积,Cn是目标物含量,As是13C3—AM速率峰面积,Cs是13C3—AM速率含量。
精确值通过恢复率和相对标准误差进行评估。恢复速率是指对样本以及标准溶液的反应速率。
结果:线性方程是y=165.22x-2.2547.相关系数是0.9983.此实验是直线型图在0—300ug/L之间,适合用于测量医用PAHG中AM含量。医用PAHG样本在提取和净化之后,通过HPLC—MS/MS获得质谱。AM的保留时间会有一个明显的分界线,在此期间有一个干扰峰值。目标物的峰形是陡峭而匀称的。在20个临床案例中,PAHG中AM含量从3.9x10-9到3.1x10-8变化。这个结果低于ISO质量标准和国际医疗设备生物评价标准。相对标准误差计算接近6.20%,用区间数据算得,而此数据来自于50ug/L的浓度比率。恢复率是103.1%。
讨论:紫外线分光光度法、气相色谱分析、液相色谱法都层用来测试AM,但是结果都令人不太满意。这些方法都有高度检测极限和干扰性因素,会严重影响结果。AM无法通过这些方法精确测出。
高效液相色谱法包含高压泵和高敏度检测器配置,高效、快速。几乎所有化合物包含高极性、离子物、高分子物质都可以通过高效液相色谱法测量。一些研究人员通常使用高效液相色谱法测量食物和水中的AM含量。尽管高效液相色谱法具有良好的重现性,但是相比HPLC—MS还是有些局限性。
HPLC—MS是一个高效分离系统,可用于多种混合物数量与质量的测量。它还能够检测出复合物的分子重量和结构信息。HPLC—MS能分析水样本并且对分析者无害。它的样本准备非常简单。在2002年的7月,WHO和FAO授权发布GC—MS和LC—MS。美国食品与药品监管局在2003年2月,发布一篇文献关于食物中AM的数量检测。结果表明,HPLC—MS对于检测AM在医用PAHG中含量更为简单。
在AM的保留时间之前,干扰峰值的原因还不清楚。这个干扰峰值有明显的分界线。在PAHG的标准检测中是没有干扰峰值的。是否此样品被血液或其它尚未清楚的人体内PAHG的分解物所污染还是个谜。对人体内血清来说,没有一个很好的样品储备。血液中的物质干扰不能够被排除。对于注射过PAHG的病人来说,外科手术是去除凝胶的最好方式。
在自然界中,PAHG(热、水解、氧化作用、催化氧化、生物催化)分解成低聚物是很慢的。比如,AM直接或间接地毁坏人的身体。我们也不能排除PAHG可能会在人体内分解成可替代化合物而不是AM。这个化合物可能会改变内在环境,比如ph值,可能会导致肌肉疼痛和其他并发症。一旦分解发生,对人体的损害是不可避免的。WHO认为水中的AM量是1ug/L。XI曾认为AM在PAHG中的浓度低于1.00x10g/ml是没有毒性的。在我们的研究中,高效液相色谱法中的浓度是14.39+6.4x10g/l。这表明,AM在医用PAHG中属于正常值范围。仍有报告表明,凝胶中AM的残留量低于1.10x10-6g/l,而且6个月后低于1.3x10-9g/L。这与我们的研究结果一致。因此,对于检测医用PAHG中AM的含量,HPLC—MS是一个更简单的方法。