二、研究的基本内容和拟解决的主要问题

1. 本课题主要是研究对二甲苯对爪蟾的行为学的影响及葡萄糖醛酸内酯对PX培养后蝌蚪生长发育的研究。

2. 主要从以下几个方面去研究：

（1）使用不同浓度的对二甲苯（PX）分别处理发育中的蝌蚪，观察蝌蚪的生长情况，找到蝌蚪的最低致死浓度和合适的处理浓度。

（2）使用合适的PX浓度处理发育过程中的蝌蚪，测试PX对蝌蚪行为学的影响。

（3）提取蝌蚪的视顶盖蛋白，通过Westernblot技术，检测PX处理对视顶盖蛋白表达的影响。

（4）使用不同浓度的葡萄糖醛酸内酯和同一浓度的PX混合培养蝌蚪，观察蝌蚪的生长情况，记录每组的蝌蚪尾部和头部的畸变数目

（5）记录每组存活数目及死亡数目

（6）行为学数据统计，主要以one-dot实验为主

（7）提取蝌蚪的视顶盖蛋白，通过Westernblot技术，检测葡萄糖醛酸内酯对PX培养后的蝌蚪的视顶盖蛋白表达的影响。

3.解决问题：

（1）对二甲苯对蝌蚪的最低致死剂量，观察蝌蚪生长发育的情况。

（2）经过对二甲苯处理后蝌蚪的尾部畸变、头部畸变、生存率和死亡率等参数的记录及通过行为学的测量技术和Westernblot技术，衡量对二甲苯对爪蟾行为学的影响。

（3）通过葡萄糖醛酸内酯+对二甲苯培养蝌蚪，观察观察蝌蚪的生长情况，记录每组的蝌蚪尾部和头部的畸变数目等数据，研究葡萄糖醛酸内酯对PX培养后蝌蚪生长发育的影响

三、研究方法及措施

1.研究方法：

在成年雌雄蛙体内分别注射HCG，雌性爪蟾注射1000单位HCG,雄性爪蟾注射500单位HCG，放在一个水箱内进行配对。受精的卵母细胞孵化后第五天开始选择活动状态良好的蝌蚪80只作为实验材料备用。

随机分成4组，设置实验组和对照组。其中1为对照组，2、3、4为实验组，各组20只蝌蚪，预实验中用20只。预实验用挑选的体表无损、活力良好蝌蚪个体10只置于对二甲苯0、1、2、2.5和4.0μmol/mL的环境下,观察蝌蚪生长状况，以探讨不同浓度对二甲苯对蝌蚪生长发育的影响。

2.具体措施：

（1）数据记录记录使用不同浓度的对二甲苯（PX）分别处理发育中的蝌蚪，观察蝌蚪的生长情况，记录，，每组蝌蚪头部畸变、头部畸变、头尾共畸变的数据及生存率和死亡率。

记录葡萄糖醛酸内酯+对二甲苯培养蝌蚪，观察观察蝌蚪的生长情况，记录每组的蝌蚪尾部、头部的畸变数目及生存率和死亡率等数据。

（2）行为学测试（one-dot）主要研究蝌蚪的视觉回避行为，即使用一个刺激的方法观察蝌蚪的游泳方式，看它是否迅速改变其游泳轨迹.通过比较空白对照组和实验组的蝌蚪对圆形光点的视觉回避行为，分析统计蝌蚪回避率的百分比得出差异性结论。

（3）Westernblot检测WesternBlot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，"探针"是抗体，"显色"用标记的二抗。经过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分，该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。

四、研究工作的步骤与进度

1.2015.7.10–2015.7.15：查阅相关文献，了解爪蟾的生活习性，繁殖方式等；查阅对二甲苯（PX)的相关文献，了解对二甲苯对生物发育影响的研究背景。