1  材料与方法

1．1 实验材料与仪器

1．1．1  实验材料

本实验中主要用到的实验材料包括：质粒空载PLKO.1-GFP载体，包装质粒PAX2、包装质粒PMD2.G，大肠杆菌的DH5a感受态细胞，293T（293T是经过腺病毒E1A基因转染的人肾上皮细胞。293T能表达SV40大T抗原，并且含有SV40复制起始点与启动子区。），Raji（人Burkitt's淋巴瘤细胞），Raji-4RH（人Burkitt's淋巴瘤细胞美罗华耐药株），哌咪清（Pimozide）。

1．1．2  仪器设备

本实验中主要用到的实验仪器包括：恒温培养振荡器，恒温水浴锅，生物安全柜，vortex涡旋振荡器，高速台式离心机，高速台式低温离心机，CO2恒温培养箱，倒置荧光显微镜，自动细胞计数仪，流式细胞仪，酶联免疫检测仪，电泳仪，全自动化学发光图像分析系统等。

1．2 方法

1．2．1  慢病毒质粒构建

本次实验中，构建质粒所用的质粒空载是PLKO.1-GFP载体，所用的限制性酶切位点是Age1和EcoR1.

（1）酶切质粒：质粒酶切体系：PLKO.1: 5ug，10x cutsmart：5ul，Age1：1ul，EcoR1：1ul，ddH2O：补充体系至50ul。37℃水浴5h。

（2）回收酶切产物：使用quiagen的PCR回收试剂盒（28104）。由于空载在经过双酶切时只有一条明显的条带，没有第二条明显的条带，所以无需切胶回收，为了提高载体的回收效率本次直接回收。

（3）退火：将订购的shRNA正反向引物通过退火形成一段有Age1和Ecor1酶切粘性末端的双链DNA序列。退火体系：shRNA（forward:10uM）：10ul，shRNA（reverse:10uM）：10ul，NEB buffer(2/2.1) ：5ul，ddH2O：25ul。然后在PCR仪里从95℃降到25℃，以每分钟降1℃的速度完成退火。

（4）连接：连接步骤（2）中得到的酶切质粒和步骤（3）中得到的退火产物，得到目的质粒。连接体系：退火产物：4ul，酶切质粒：30ng，T4连接酶缓冲液：2ul，T4连接酶：0.5ul，ddH2O：补充体系至20ul。然后在PCR仪中22℃连接2小时或4℃连接过夜，-20℃冰箱中保存备用。

1．2．2  慢病毒质粒转化、培养及抽提

（1）称取适量的LB肉汤培养基粉末溶于水中配置成25 g/L 的LB液体培养基，每100ml再加入1.5g琼脂粉，放入灭菌锅中高压蒸汽灭菌0.5h，降至室温后每1ml加入100μg 氨苄青霉素，混合均匀，趁热倒平板。

（2）从-80℃冰箱中取出DH5a感受态细胞，从-20℃冰箱中取出目的质粒，放在冰上融化。融化后取100 ng质粒和5μl Stbl 3感受态细胞于新的1.5 ml 离心管中，放在冰上静置30 min，再放入42 ℃水浴锅中热击1min，立即转移至冰上静置2 min。然后加入100 μl已灭菌的LB液体培养基重悬，混合均匀，滴加在之前倒好的LB固体培养基平板上，加入几颗干净的珠子，在台面上晃动，使液体均匀涂布在平板上，倒掉珠子，室温放置10 min，然后倒置放入37 ℃培养箱中培养过夜，第二天上午取出后倒置放入4 ℃冰箱中保存备用。

（3）在超净台中，取洁净的50ml离心管，加入35 ml含有100 μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基，用枪头挑取平板中的单个菌落，要求菌落外周饱满圆润并且生长状况良好，并将枪头打入离心管中，放在37 ℃摇床中，250 rpm/min孵育过夜（也可以先在1.5ml洁净离心管中，加入1ml含有100 μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基，用枪头挑取平板中的单个菌落，并将枪头打入离心管中，放在37 ℃摇床中，250 rpm/min孵育过夜，第二天取出后将菌液转入加有35 ml含有100 μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基的50ml离心管中，放在37 ℃摇床中，250 rpm/min孵育过夜）。

（4）第二天上午取出离心管，抽提质粒。用购买于天根生物科技有限公司的无内毒素质粒小提中量试剂盒进行抽提。