A 平衡吸附柱：将吸附柱放入收集管中，并且加入500 μl平衡液，12000rpm/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

B 将过夜培养的菌液加入离心管中，12000rpm/min离心1min，倒掉上清，如果菌液太多，可分多次离心。

C 首先在P1溶液中加入RNaseA，混匀。再向有菌体沉淀的离心管中加入500μl P1溶液，充分悬浮细菌细胞沉淀，可用移液枪吹吸，或用涡旋振荡器混匀。

D 混匀后加入500μl P2溶液，缓慢地上下颠倒6-8次，充分裂解菌体。

E 再加入500μl P4溶液，立即缓慢地上下颠倒6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀，然后室温放置10min左右，12000rpm/min离心10min，此时白色沉淀会全部到离心管底部，保留上清。

F 将E中收集的上清加入过滤柱中，过滤柱放在新的2ml离心管中，12000rpm/min离心2min。若上清很多，可分次加入。

G向离心管中加入0.3倍滤液体积的异丙醇，上下颠倒混匀后转移到吸附柱中，吸附柱放入收集管中。

H室温12000rpm/min离心1min，倒掉收集管中的废液，因为液体体积大于吸附柱的容积，所以溶液需要分次过柱。

I 向吸附柱中加入500μl去蛋白液，12000rpm/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。

J 继续加入600μl漂洗液，12000rpm/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱再次放入收集管中。

K 重复J步骤，再向吸附柱中加入600μl漂洗液，12000rpm/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

L 12000rpm/min离心2min，去除吸附柱上残余的漂洗液。

M 将吸附柱放入一个新的1.5ml离心管中，在中间位置滴加100-300 μlddH2O，室温放置2min，12000rpm/min离心1min。为了提高回收效率，可将滤液重新加入吸附柱中，再次12000rpm/min离心1min。

N 进行浓度测定。检测完浓度之后，可使用配置的1%琼脂糖凝胶进行DNA电泳验证抽提是否成功。

1．2．3  293T、Raji和Raji-4RH的复苏、培养和传代

（1）准备培养基。293T需用DEME完全培养基（高糖）培养，该培养基中包含10%的牛胎儿血清（fetal bovine serum，FBS） ，50 U/ml的青霉素 、50 μg/ml的链霉素。Raji和Raji-4RH需用BL培养基培养，该培养基由1640完全培养基配制，其中包含10%的热激灭活牛胎儿血清（fetal bovine serum，FBS），50 U/ml的青霉素 、50 μg/ml的链霉素，丙酮酸钠。

（2）从液氮或-80 ℃冰箱中取出冻存的293T，Raji和Raji-4RH，立即放入37 ℃温水中进行融化。融化后将细胞转移到1.5 ml离心管中，并加入1 ml相应的培养基，放入离心机，800 rpm/min离心3 min，弃上清。加入1ml磷酸缓冲液（PBS溶液），吹匀细胞，800 rpm/min离心3 min，弃上清，可重复洗两次。洗完后用1ml相应的培养基重悬细胞沉淀，混合均匀，转移至直径为6cm培养皿（或直径10cm的培养皿或者培养瓶）中，再加入3ml培养基（如果需要可以加入支原体去除剂防止污染），在实验台上“十字”摇匀，放入37 ℃细胞培养箱中培养。

（3）以后每天对细胞进行换液。Raji和Raji-4RH属于悬浮细胞，换液时先将培养皿中的细胞转移至5ml离心管中，800rpm/min离心3min，弃上清，加入1ml PBS溶液，吹匀细胞，800rpm/min离心3min，弃上清，加入1ml培养基重悬细胞，再转移至加入新的3ml培养基的培养皿中，摇匀，放入37℃培养箱中继续培养。293T属于贴壁细胞，换液时需提前将培养基放在37℃预热。然后吸出旧的培养基，沿培养皿内壁缓慢加入新的预热的培养基，尽量减少细胞被冲起。

（4）细胞传代。悬浮细胞：先将培养皿中的细胞转移至5ml离心管中，800rpm/min离心3min，弃上清，加入1mlPBS溶液，吹匀细胞，800rpm/min离心3min，弃上清（可用PBS洗两次），加入3-4ml培养基重悬细胞（根据细胞密度决定），吹匀细胞，再转移至3-4个加入新的3ml培养基的培养皿中，每个培养皿加入1ml，摇匀，放入37℃培养箱中继续培养。贴壁细胞：首先37℃预热培养基，PBS和胰酶，然后吸出旧的培养基，加入1-2ml胰酶（根据细胞数量确定）消化细胞，室温放置1-2min，再加入1-2ml培养基终止反应。将细胞液转移至5ml离心管中800rpm/min离心3min，弃上清，加入1mlPBS，吹匀细胞，800rpm/min离心3min，弃上清，加入3-4ml培养基重悬细胞（根据细胞密度决定），吹匀细胞，再转移至3-4个加入新的9ml培养基的培养皿中，每个培养皿加入1ml，摇匀，放入37℃培养箱中继续培养。