摘    要：目的：利用农杆菌介导的转基因技术将关键酶基因CwDXR转入烟草并诱导生成毛状根，分析阳性单克隆烟草毛状根中目的基因的表达量，从而得到关键酶基因高表达的烟草毛状根。方法：对榄香烯生物合成途径上的关键酶基因CwDXR进行烟草密码子优化后，克隆到植物双元表达载体pCAMBIA1301上，并转入发根农杆菌中，利用农杆菌浸染烟草外植体，诱导生成含目的基因的毛状根，利用荧光实时定量PCR技术分析烟草毛状根单克隆内CwDXR特异性表达水平。结果：成功将目的基因CwDXR转入烟草并诱导毛状根的产生，通过检测分析发现转入基因的不同毛状根单克隆内，基因表达水平存在着明显差异。结论：发根农杆菌在携带外源基因转入烟草细胞内时，整合位点存在着极大随机性，使目的基因在烟草毛状根内的表达量受到影响。

关键词：发根农杆菌； 转基因； 毛状根； 基因表达量差异

Abstract： Objective：To transfer the key enzyme gene CwDXR into tobacco and induce the hairy roots by using transgenic technology. Then, the expression levels of the target genes in transgenic hairy roots were analyzed,and tobacco hairy roots with high expression of key enzyme genes were obtained. Methods：Firstly,to optimize the key enzyme gene CwDXR of elemene biosynthesis pathway.Secondly,cloning the gene CwDXR onto the expression vector pCAMBIA1301, and turning into the agrobacterium rhizogenes.The Target genes were transformed into tobacco leaves to induced hairy roots through infecting tobacco plants by agrobacterium rhizogenes.Then,analyzing the expression levels of the target genes in transgenic hairy roots by real-time fluorescence quantitative PCR. Results：I succeed in transfering CwDXR into tobacco and inducing the hairy roots.The results showed that the expression levels were significantly different in various transgenic hairy roots. Conclusion：When the exogenous gene was carried into the tobacco cells, there was a great randomness in the integration site,and the expression of the target gene in the hairy roots of tobacco will be affected.

Keyword: Agrobacterium rhizogenes； Transgene； Hairy roots； Difference of gene expression

目    录

1. 引言 1

1.1 β-榄香烯的生物合成途径 1

1.2毛状根简介 2

1.3转基因毛状根培养技术 3

1.4实验目的和意义 4

2. 实验材料 5

2.1植物材料 5

2.2试剂与药品 5

2.3载体及构建的菌株 6

2.4常用试剂配制方法 6

2.5主要仪器设备 7

3. 实验方法 8

3.1烟草无菌苗萌发 8

3.2构建重组发根农杆菌 8

3.2.1构建基因双元表达载体 8

3.2.2农杆菌感受态细胞的制备 9

3.2.3重组质粒转化农杆菌感受态细胞 9

3.2.4重组菌株的验证 9

3.3重组菌株活化 10

3.4烟草转基因毛状根的诱导 11

3.5烟草转基因毛状根的PCR分子检测 11

3.6烟草转CwDXR基因毛状根的继代、增殖培养 12

3.7烟草转基因毛状根的总RNA提取 12

3.8反转录PCR合成cDNA 13

3.9目的基因在不同烟草毛状根单克隆中的表达差异分析 14

4. 实验结果 15

4.1烟草无菌苗萌发结果 15

4.2重组菌株的PCR验证结果 15

4.3烟草转基因毛状根的诱导结果 16

4.4转基因烟草毛状根CwDXR基因片段PCR检测结果 17

4.5目的基因在烟草毛状根不同单克隆内特异性表达结果 17

5. 实验结论 19

参考文献 20

致谢 22

1. 引言

1.1 β-榄香烯的生物合成途径

萜类化合物是植物次生代谢产物中最大的一个家族，是由异戊二烯单元组成化合物及其衍生物，在自然界中广泛分布[1]。β-榄香烯（β-elemene）是温郁金块根中提取得到的一种有抗癌活性的萜类化合物[2]。