基于“土著”微生物对雌激素的降解能力，学者们尝试采用高温堆肥[5]、厌氧消化[6]等方法，来提高畜禽粪便中雌激素降解的效率。然而，作为环境友好方法，好氧堆肥和厌氧消化并不能完全去除畜禽粪便中的雌激素，处理后的畜禽粪便仍残留高剂量的雌激素污染物，并对生态环境造成严重危害。

固定化微生物技术是从20世纪60年代开始迅速发展起来的一项新技术，它是通过一定的技术手段将菌体固定在载体上，避免菌体流失，提高菌体利用效率，从而达到简化处理工艺，提高处理效率的目的[7]。

应用固定化微生物处理难以生物降解的有机污染物目前在国内外取得了阶段性的进展，并成为环境保护研究的热点，充分显示了其独特的优越性，因此微生物固定化技术的研究具有重要的理论价值和现实价值。

本研究采用海藻酸钠作为载体对一株经过筛选鉴定的高效雌二醇降解菌进行包埋，通过正交实验确定固定化E2降解菌剂的最佳包埋条件，并对比了固定态E2降解菌株和游离态E2降解菌株对水中E2的去除效果以及固定化后温度、pH、底物浓度等环境因素对降解效果的影响，最后通过实验分析固定化E2降解菌剂对另外两种雌激素的降解效果来研究固定化E2降解菌剂对去除水中雌激素的广谱性，期待最终能够应用到实际污水和畜禽粪便中雌激素的处理过程。

1 材料与方法

1．1 实验材料

供试菌：菌株为 Novosphingobium sp.ARI-1，购自 ATCC，编号 BAA-531。

化学试剂：E2（纯度≥98%）、E3（纯度≥98%）、E1（纯度≥98%）均购自上海阿拉丁试剂有限公司。甲醇和乙腈为色谱醇。海藻酸钠为化学纯，CaCl2·2H2O为分析纯。

R2A 培养基（g·L-1）：胰蛋白胨0.25，酸水解酪蛋白 0.5，酵母浸粉 0.5,可溶性

淀粉0.5，磷酸氢二钾0.3，硫酸镁0.1，丙酮酸钠0.3，蛋白胨0.25，葡萄糖0.5,pH 7.0~7.4。

无机盐培养基（MSM）（g·L-1）：（NH4)2SO 4 1.50，K2HPO4·3H2O 1.91，KH2PO4 0.50，NaCl 0.50，MgSO4·7H2O 0.20，微量元素溶液2 mL，pH 7.0。其中微量元素溶液成分（g·L -1）：CoCl2·6H2O 0.1，MnCl2·4H2O 0.425，ZnCl2 0.05，NiCl2·6H2 O 0.01，CuSO4·5H2O 0.015，Na2MoO4·2H2O 0.01，Na2 SeO4·2H2O 0.01。

E2 降解培养基：移取一定量的 E2 母液至无菌三角瓶中，待甲醇挥发后，加入MSM，使 E2 最终浓度达到实验设计浓度。

1．2 主要仪器

高效液相色谱(岛津LC-20AT)

大容量高速冷冻离心机(美国Beckman)

紫外可见分光光度计(日本Shimadzu)

1．3 研究方法

1．3．1 固定态菌剂的制备

用接种环从培养基平板上取菌体接入R2A培养基中，30℃、150 r·min-1摇床培养18小时后取出，把细菌培养液加入离心管，用天平两两配平后放入离心机，离心收集菌体，用无菌水洗涤2遍，制成菌悬液。另外配制一定浓度的海藻酸钠溶液，121℃灭菌，冷却后与菌悬液按一定的比例混合，用胶头滴管吸取混合液逐滴滴入一定浓度的CaCl2溶液中，形成乳白色的固定化小球，然后置于4℃冰箱中交联一定时间后，用无菌水滤洗后备用。

1．3．2 固定化雌二醇（E2）降解菌剂对水中 E2 的去除作用

在三角瓶中加入浓度为50 mg·L-1的E2，自然风干后加入MSM培养基，再加入 150 g·L-1 已经制好的固定态菌剂，30℃、150 r·min-1 摇床中培养，每 24 h 取样，测定培养液中 E2 浓度，计算 E2 去除率。接入与之前相等菌量的游离菌剂的处理作为阳性对照，不接种降解菌的空白小球的处理作为阴性对照。

1．3．3 外部条件对固定态菌剂降解E2效果的影响

主要研究温度、pH、接种量对固定化 E2 降解菌剂去除 E2 的影响，以接入相等菌量的游离菌剂的处理作为阳性对照，以 E2 去除率为指标，获得最适宜固定化E2降解菌剂发挥功能的外部条件。