1.1.2 病原菌的分离与纯化

   采集番茄发病植株，切下其根部以及茎部，分别取长约5~6mm的一段。用75%的无水乙醇浸泡90s，无菌水冲洗2~3次，0.1%的升汞中处理7~8min，无菌水冲洗5~6次，用无菌吸水纸将其表面水分吸干，然后将其放入马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）上28℃培养。当其生长5~6d时可以看到白色突起的菌落，用接种针挑取菌落边缘菌丝，再接种于新的PDA培养基上，进行多次重复操作，直到菌落单一无杂菌[14]。

1.2 病原菌形态学观察

1.2.1 菌落形态的观察

   用接种针挑取纯化的番茄根腐病菌的菌丝，将其接种于新的PDA平板中央，28℃恒温箱培养7d。观察该菌株菌落形态、透明度、光泽度、质地、隆起形状、边缘特征等。

1.2.2 菌丝、孢子性状观察

从纯化的番茄根腐病病原菌菌落边缘挑取少量菌丝，将其接种于新的PDA平板中央，28℃恒温箱培养7d。用无菌水冲洗菌落，充分震荡，制成孢子悬浮液。沾取少量悬浮液于载玻片上，显微镜下观察孢子形状、大小、颜色，以及菌丝形状、颜色、粗细等[15]。

1.3 病原菌分子鉴定

1.3.1 病原菌 DNA 的提取

   采用生工生物工程（上海）股份有限公司生产的Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒（真菌），方法参照其说明书。

1.3.2 PCR扩增

采用真菌通用引物对ITS1/ITS4进行PCR扩增[16]，其反应体系如下：模板DNA 1μL； 10pmol/mL的ITS引物各1μL ；2×EasyTaq Super Mix 10μL；加ddH2O补足20μL。PCR反应条件为：预变性94℃，5min；变性94℃，30s；退火

45s；延伸72℃，1min；再延伸72℃ 5min；34个循环。在本次PCR扩增的过程中，设置了4个不同的温度梯度，分别是50℃、52℃、56℃、58℃，用以探究扩增的最佳条件。

1.3.3 测序及系统发育树分析

将PCR扩增产物送到南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序，得到序列后将序列在NCBI中进行比对[17]、上传，并命名为Fusarium solani isolate ZK004 18S ribosomal RNA gene。并运用MEGA5[18]软件进行分析[19]，研究其与其他病原菌的进化关系。

1.4 不同培养基对病原菌生长的影响

将在PDA平板上生长的病原菌用打孔器扎取边缘一圈的菌落，接种于不同的培养基的正中间，7d后观察病原菌的生长形态，分析其在不同培养基上的生长速度、菌丝生长是否旺盛、不同培养基上菌丝颜色形态等。并以此试验寻找出根腐病菌的最适生长培养基，用于以后的研究。