1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

本实验以胡萝卜(Daucus carota L.)的'Purple haze'胡萝卜和番茄（Solanum lycopersicum）的'Micro-Tom'番茄为植物材料。其中胡萝卜于2017年3月上旬种植于南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室人工气候室，时间温度控制：发芽时候将温度控制在20-25 ℃之间，白天生长期间温度控制在25 ℃左右，在夜间生长期间将温度控制在20 ℃左右。番茄于2018年6月种植于南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室人工气候室，温度控制在25 ℃。

1.1.2 试剂盒

胡萝卜总RNA的提取采用RNA simple Total RNA Kit（Tiangen公司)试剂盒，总RNA反转录成cDNA利用Prime Script RT reagent Kit(TaKaRa公司)试剂盒。

1.2 实验方法

1.2.1 胡萝卜总RNA的提取及cDNA的合成

采用紫胡萝卜品种'Purple haze'胡萝卜植株的根作为实验材料，并加入液氮速冻，将材料保存于-80 ℃冰箱中。采用RNA simple Total RNA Kit（Tiangen公司)试剂盒提取胡萝卜叶片总RNA，并按照试剂盒上的说明书进行实验操作。在cDNA合成的实验过程中使用的全部塑料制品均为无RNA酶产品。RNA样品的浓度和纯度通过NanoDropND 1000分光光度计测定，且OD260/280的比值介于1.8-2.0的样品用于后续反转录实验。利用Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa公司)试剂盒将总RNA反转录成cDNA。采用20 μL反转录反应体系，1 μg的Total RNA。具体过程按Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa公司)试剂盒上的说明书进行实验操作。

1.2.2 'Purple haze'胡萝卜DcMYB113基因的克隆

根据胡萝卜基因组中预测MYB113的ORF序列，并设计一对克隆引物：MYB113-F (5'-3'): ATGAGCTATCCCAAGGCCATGAAG和MYB113-R (5'-3'): TTATAATCGACTCA- ATCGGACATAAT。以'Purple haze'的cDNA为模板，利用以上引物进行PCR的扩增。PCR反应中用PrimerSTAR Max DNA聚合酶，在PCR仪上面进行变性、退火、延伸反应。在PCR反应中采用三温度点法，双链DNA在98 ℃变性，再迅速冷却至58 ℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至72 ℃，在DNA聚合酶的作用下，使引物沿模板延伸。

1.2.3 目的基因载体构建和转化农杆菌

将从'Purple haze'紫胡萝卜中克隆出的DcMYB113基因，构建在pCAMBIA 2300植物表达载体上的CaMV35S启动子和Nos终止子之间。经过电击转化，将含有目的基因的载体转化至根癌农杆菌GV3101中。

电击转化农杆菌感受态细胞：

（1）-20 ℃预冷电击杯，预冷不含抗生素的YEP培养液。

（2）取出100 μL农杆菌感受态细胞在冰上冻融，再加上2 μL质粒DNA于感受态细胞中，并用枪头轻轻将其混匀。

（3）取出质粒DNA和农杆菌感受态的混合物，将其转入预冷-20 ℃的电击杯中，并在2500V的高压下进行电击。

（4）在电击杯中加入预冷的不含有抗生素的YEP培养液，混匀并用枪头吸出菌液转入1.5 mL离心管中，28 ℃，200 rpm振荡培养。

（5）取30 μL菌液，放在含有抗生素的YEP培养液上，28 ℃倒置培养2天。

1.2.4 农杆菌遗传转化

（1）番茄的培养

首先催芽，把番茄种子用75%的乙醇洗两次，后用20%的NaClO清洗10-15 min,再用灭好菌的ddH2O洗5次，再放入MS培养基，25 ℃暗培养，待下胚轴长2-3 cm时光培养。待番茄幼苗2片叶子完全展开时，将幼苗的子叶切成小段转至培养基培养2天。

（2）导入基因获得新植株

将摇好的含有目的基因的菌液侵染预培养基中的外植体，侵染10-20 min后倒净菌液，放入共培养培养基上暗培养2-3天。

（3）筛选生根

将共培养基中的外植体转入筛选培养基于28 ℃培养，每半个月换一次培养基，获得抗性植株，3周后将外植体转入生根培养基中。