在全世界主要的10种植物真菌病害排名中，由尖孢镰刀菌引起的植物枯萎病名列前茅[6]。枯萎病病原菌寄主范围广泛，目前，国外已经报道的被害植物有西瓜、黄瓜、苦瓜、哈密瓜、甜瓜等多种种蔬菜、以及花卉、棉花、甘蔗、香蕉等经济作物。在分类学上，尖孢镰刀菌属于半知菌类，从梗孢目，瘤座孢科、镰刀菌属。目前，国内外报道的尖孢镰刀菌专化型侵染葫芦科植物的，最少有8种即尖孢镰刀菌黄瓜专化型（F.oxysporum Schl.f.sp.cucumerinum Owen）、尖孢镰刀菌西瓜专化型（F.oxysporum f.sp.niveum Snyder & Hansen）、尖孢镰刀菌甜瓜专化型（F.oxysporum f.sp.melonis Snyder & Hansen）、尖孢镰刀菌丝瓜专化型（F.oxysporum f.sp.luffae Kwai Suzuli & Kawai）、尖孢镰刀菌葫芦专化型（F.oxysporum f.sp.lagenariae Matuo & Yamamoto）、尖孢镰刀菌苦瓜专化型（F.oxysporum f.sp.momordicae Sun & Huang JW）、尖孢镰刀菌冬瓜专化型（F.oxysporum f.sp.benincasae Gertagh M & Ester A）、尖孢镰刀菌瓜类专化型（F.oxysporum f.sp.cucurbitacearum Gertagh M & Block WJ）[3、7]等，有些专化型还根据不同的品种划分为不同的生理小种。造成苦瓜枯萎病的是尖孢镰刀菌苦瓜专化型，该转化型专一性侵染苦瓜[10]，且温度越高苦瓜发病越严重，枯萎死亡的也越快。

基于以上问题，本文将对河南省郑州市的苦瓜枯萎病病原菌进行分离、鉴定和致病性测定，为苦瓜枯萎病的预防和控制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验试材

苦瓜发病植株：取自河南省郑州市绿源蔬菜种植园区和郑州市蔬菜研究所试验基地

供试苦瓜品种：P1、P2、如玉41号、长绿苦瓜

1.1.2 主要培养基

PDA培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂15～20 g，蒸馏水1 L。

Bilay培养液：KH2PO4 1 g、MgSO4 0.5 g、KCl 0.5 g、MnSO4 0.5 g、葡萄糖 0.2 g、淀粉 0.2 g、蔗糖 0.2 g、蒸馏水 1 L。

绿豆培养液：绿豆30 g、蒸馏水1 L 。  

Armong培养液：KH2PO4 1.1 g，MgSO4 0.4 g、KCl 0.5 g、葡萄糖20 g、Ca(NO3)2 5.9 g、ZnSO4 0.2 g 、MnSO4 0.5 g、FeCl3 0.2 g、蒸馏水 1 L。

上述培养基的灭菌方式均为高压蒸汽灭菌，条件是121℃，15 min。

1.1.3仪器设备

超净工作台、精密电子天平、各种规格的容量瓶、培养皿、移液枪、研钵、-20℃冰箱、-80℃冰箱、26℃恒温摇床、26℃恒温培养箱、恒温水浴锅、电泳仪、离心机、显微镜、PCR仪、微波炉、烘箱、冷冻干燥机、高压蒸汽灭菌锅等。

1.2 主要实验方法

1.2.1苦瓜枯萎菌的分离和纯化

把采自河南省郑州市蔬菜种植园区和绿源蔬菜所的苦瓜枯萎病病株用常规的植物组织分离法分离。即取苦瓜枯萎病病株褐色的茎基部组织，切成小块，在75%的酒精中消毒1 min左右，无菌水冲洗3遍，置于灭菌滤纸上吸干水分，转入PDA培养基上，25℃恒温培养4~5 d[5]，在单菌落上挑取菌丝转接，重复转接，直到纯化完全。将纯化后的病原菌分别用25%的甘油和斜面培养基保存在4℃冰箱中备用。

1.2.2 柯赫氏法则的验证

通过对分离物进行寄主回接测定，健康的苦瓜幼苗发病，与田间自然发病的苗期症状一致，对人工接种后的植株进行组织分离所得到的病原菌也与接种前一致。通过镜检可见尖孢镰刀菌大、小分生孢子，清水对照组不发病，且镜检时没有发现尖孢镰刀菌的大孢子、小孢子等，验证了柯赫氏法则。结果显示分离物为苦瓜枯萎病的病原菌，从而进一步显示该苦瓜枯萎病菌对苦瓜具有致病性。

1.2.3苦瓜枯萎菌的培养及形态学观察

挑取纯化后菌株的菌丝转接于PDA培养基上置于25℃恒温培养箱中，5 d后测量并记录菌落的直径、颜色，菌丝生长方式等形态特征；小型分生孢子、大型分生孢子和厚垣孢子的形态和着生方式；产孢细胞的形态结构特征；分生孢子座等情况，且拍照。