摘要：硫化氢（H2S）是继一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）后发现的第三种气态信号分子，其合成途径在动物、植物、微生物中略有不同，但主要合成途径有两种：一种是同化硫酸盐途径，另一种为降解半胱氨酸途径。本实验通过对灵芝中合成内源硫化氢相关的酶进行生物信息学分析，对其进行基因克隆，并完成其沉默载体的构建。同时灵芝三萜类化合物是灵芝的次级代谢产物，它含量的多少已经成为评价灵芝质量的重要指标。本实验也通过转化入构建好的沉默载体并测量转化后的灵芝中的三萜含量，从而分析内源硫化氢对灵芝表型的影响。

关键词：硫化氢（H2S）；基因克隆；沉默菌株；转化；三萜

Gene cloning of the key enzyme which is related to the synthesis of hydrogen sulfide in Ganoderma lucidum and the construction of its silent strain

Abstract：Hydrogen sulfide (H2S) is considered as a novel gasotransmitter after nitric oxide(NO) and carbon monoxide(CO).The synthetic pathway is slightly different in animals,plants and microorganisms,however there are two main synthetic routes:one is the assimilation of sulfate ,and the other is to degrade the cystetine. In this experiment, we analysis the bioinformatics of the key enzyme ,start gene cloning of the key enzyme and constructing its silent strain. Meanwhile, Ganorderma triterpenes are important secondary metabolites of Ganorderma lucidum, GAs contents have become an important standard to evaluate the quality of G. lucidum. This experiment through transforming silent strain into G. lucidum measures the contents of GAs.Consequently,we can analyze the effect of endogenous hydrogen sulfide in G. lucidum’s phenotype.    

Key words: Hydrogen sulfide (H2S);  Gene cloning; Silent strain; Transform; GAs

目  录

摘要1

关键词1

Abstract1

Key words  1

引言（或绪论）1

1材料与方法 3

1.1实验材料 3

1.1．1菌株与质粒 3

1.1.2培养基的配制 3

1.1.3菌株培养 3

1.1.4主要仪器 3

1.2实验方法 3

1.2.1灵芝中合成内源硫化氢相关的酶的生物信息学分析 3

1.2.2关键酶的沉默载体的构建 3

1.2.2.1设计引物 3

1.2.2.2 PCR扩增目的片段 3

1.2.2.3割胶回收 4

1.2.2.4转化 4

1.2.2.5送测结果验证 5

1.2.2.6碱裂解法提质粒 5

1.2.2.7酶切与回收 5

1.2.2.8沉默基因与沉默载体酶连 5

1.2.2.9转化与测序 6

1.2.2.10分装保存菌液与质粒6

1.2.3灵芝电击转化及转化子的筛选 6

1.2.3.1灵芝不完全酶解原生质体备 6

1.2.3.2电击转化及转化子的筛选 6

1.2.4分光光度计测三萜含量 6

1.2.5 QRT（实时荧光定量PCR）7

2结果与分析7

2.1目的基因生物信息学分析 7

2.1.1灵芝中与植物中酶CS相似的蛋白GL17604的进化树7

2.1.2灵芝中与植物中酶SR相似的蛋白GL20411的进化树8

2.1.3灵芝中与动物中酶CBS相似的蛋白GL21781的进化树 9

2.1.4灵芝中与动物中酶CSE相似的蛋白GL17879的进化树 9

2.2设计沉默片段引物10

2.3沉默片段经过PCR扩增和连T转化后的电泳图10

2.4连T后的沉默片段送去测序公司的测序结果11

2.5测序成功的沉默片段和沉默载体PMI提质粒结果11

2.6连T后的沉默片段和沉默载体PMI酶切结果12

2.7酶切成功的沉默片段和沉默载体酶连后，转化验证凝胶电泳图12

2.8酶连成功验证后的菌液测序结果13

2.9 CBS转化子筛选13

2.10 CBS转化子三萜含量测定 13

3讨论  14

致谢 14

参考文献 14

附录 16

灵芝中合成内源硫化氢关键酶的基因克隆及其沉默菌株的构建

引言

灵 芝 Ganoderma Lucidum（Curtis ：Fr）P.Karst. 属于真菌界担子菌门层菌纲多孔菌目灵芝科灵芝属，别名：赤芝、红芝、丹芝、灵芝草、仙草、瑞草、三秀、木灵芝、菌灵芝、万年蕈。灵芝子实体大多为一年生，少数为多年生，有柄，小柄侧生。菌盖木质，木栓质，扇形，具沟纹，肾形、半圆形或 近 圆 形，5~20×8 ~28 cm， 厚 0.5~ 2 cm，或 5~15 cm 宽 , 表面褐黄色或红褐色，血红至栗色，有时边缘逐渐变成淡黄褐色至黄白色，具似漆样光泽，盖表有同心环沟，或环带棱纹，并有辐射状的皱纹，边缘锐或稍钝 ，有时成截形，往往内卷。菌肉厚 0.5~0.8 cm，白色至淡褐色，接近菌管处常成淡褐色，菌管小 , 长 0.5~0.8 cm。管孔面淡白色，白肉桂色，淡褐色至淡黄褐色，管口近圆形，每毫米4~6 个。菌柄侧生、偏生或中生，近圆柱形，有时粗细不等或近念珠状，与菌盖同色或稍深紫褐色，有较强的漆样光泽。担孢子卵形或顶端平截，双层壁 , 外壁透明、平滑 , 内壁褐色或淡褐色，具小刺，中央具一油滴，8.5~12 × 4.5~7.5 µm[1]。