___________________________

                                        28个循环

（7）制胶（0.5g琼脂糖+ 50mL电极缓冲液），跑胶（150V，约10分钟）

（8）用凝胶电泳成像仪观察PCR之后的电泳条带，挑选出有条带的引物，完成第一轮筛选

1.2.2.3割胶回收（SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收）

（1）做一块电泳回收胶，将上一步骤挑选出的引物再次PCR扩增模板，将得到的目的片段跑胶，然后运用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收

（2）从琼脂糖凝胶中割下目标片段的胶块，分别放入标记号的无菌离心管中

（3）加入450μL的Buffer B2，50℃水浴5~10min溶胶

（4）对于< 500bp的片段，加入150μL的异丙醇

（5）将溶胶液转入吸附柱中，8000rpm，离心30s。倒掉收集管中液体

（6）加入500μL Wash Solution，9000rpm，离心30s，倒掉收集管中液体

（7）重复步骤6一次

（8）空吸附柱于9000rpm离心1分钟

（9）将吸附柱放入一个干净的1.5mL离心管中，在吸附膜中央加入15~40μL Elution Buffer，室温静置1分钟后，离心1分钟。保存管中DNA液体

1.2.2.4转化

（1）连T——19ST克隆体系：

      目的基因           7μL

      T载体             1μL

      T4连接酶          1μL

      10X T4 buffer       1μL

        总体积：10μL（4℃过夜）

（2）取已制备好的100μL感受态细胞（于冰盒上，缓慢解冻），加入连接完毕的19ST载体（10μL体系），轻轻混匀，冰上置30min

（3）42℃热激45s，冰上置1min

（4）加无抗生素液体LB培养基100μL，37℃摇床摇菌1h

（5）涂布于LB+AMP（氨苄）的平板培养基上，37℃过夜（12~14h）。100mL LB培养基+ 100μL AMP

（6）待菌落长到1mm时，每个培养皿随机选取8个单菌落，分别加入含800μL的LB+AMP培养基的离心管中，摇菌1夜（9~10h）