1.1.2 培养基的配制    

（1）CYM培养基

1% 麦芽糖，2% 葡萄糖，0.2% 酵母提取物（Yeast Extract），0.2% 蛋白胨（Peptone），0.05% 七水硫酸镁，0.46% K2HPO4。若配置固体培养基，则再加入2g琼脂条。

（3）PDA培养基（1L）

去皮马铃薯200g，葡萄糖20g。若配置固体培养基，则再加入2g琼脂条。

（3） LB培养基（1L）

胰蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeast Extract）5g，NaCl 10g，ddH2O定容至1L，pH 7.0。若配置固体培养基，则再加入2g琼脂条。

1.1.3 菌株培养

一级种子培养：固体斜面种转接至PDA固体培养基上，培养在28℃，5d。

二级种子培养：选取菌丝边缘的菌块，并转接至含有100mL PDB培养基的250mL摇瓶中，转速150rpm，28℃黑暗下培养7d。

液体发酵：二级种子打碎均匀后，将所获得的菌丝体悬液接种至含有100mLPDB培养基的250mL三角瓶中，150rpm，在28℃振荡暗培养7d。

1.1.4 主要仪器

ABI 2720型PCR仪，冰箱，超净工作台，水浴锅，DYY-10C型电泳仪，DYCZ-20B型电泳槽，Eppendorf Centrifuge 5417R型台式低温高速离心机，凝胶电泳成像仪    

1.2 实验方法

1.2.1 灵芝中与合成内源硫化氢相关的关键酶基因的生物信息学分析

（1）运用NCBI将动物、植物、微生物中与合成内源硫化氢相关的酶在真菌中进行搜索，比对出灵芝库中的相似蛋白，再将该蛋白的名称去灵芝库中找到它的cDNA序列，最后将的得到的cDNA序列再去NCBI中反对比，进一步确认灵芝中与合成内源硫化氢相关的关键酶

（2）用得到的cDNA序列在Primer5.0中翻译出蛋白序列

（3） 在灵芝的基因库中，运用Bioedit程序，通过cDNA的一头一尾找出该蛋白的gDNA序列

（4） 运用KEGG数据库中查找与灵芝中与合成内源硫化氢相关的酶亲缘性近的其他物种中的酶，并用MEGA程序画出该基因与其他亲缘物种的进化树

1.2.2 灵芝中合成内源硫化氢关键酶的沉默载体的构建

1.2.2.1 设计引物

用Primer5.0设计目的基因沉默片段的特异引物

1.2.2.2 PCR扩增目的片段

（1）将从生工处购得的粉末状引物，12000rpm，1min离心，使粉末沉淀

（2）根据引物管上标签，加入所需ddH2O，振荡仪振匀

（3）稀释10倍：90μL去离子水+10μL引物

（4）PCR体系：

      10X PCR buffer        2.5μL

      dNTPs                2μL

      rTaq                 0.2μL

      上游引物F           1μL

      下游引物R           1μL

      模板                 1μL

ddH2O                17.3μL

__________________________________________

               总体积：25μL

（5）低速离心机，离心混匀

（6）放入PCR仪，设置扩增程序为：94℃        10min

                                    94℃        30s

                                    55℃        30s

                                    72℃        40s

                                    72℃        5min