1.1.1 培养基与试剂 配置5000 mg/L的麦草畏原药。无机盐培养基MM （g/L）：KH2PO4 0.5，K2HPO4 1.5，NaCl 0.5，NH4NO3 1.5，MgSO4·7H2O 0.2，去离子水1000 mL，pH 7.0。富集及分离培养基：在每100 mL的MM培养基中加入2 mL的麦草畏原药作为唯一碳源，培养基中麦草畏浓度为100 mg/L。全营养培养基LB（g/L）：蛋白胨10.0，酵母膏5.0，NaCl 10.0，去离子水1000 mL，pH 7.0。固体培养基，在液体培养基中每1000 mL再加入15 g琼脂。

1.1.2 富集传代培养 在含100 mg/L麦草畏的无机盐培养基中分别加入10 g取自烟草地和低盐地的土壤样品，封口，标记，于30℃，振荡培养，同时制作对照（CK），用灭菌后的含100 mg/L麦草畏的无机盐培养基作为对照。7天后，吸取富集液的上清液，离心，用紫外分光光度计来检测麦草畏的利用率，无机盐溶液作为基准，扫描波长为200-350 nm，麦草畏的吸收峰约为275 nm。同时取2 mL接种到经过灭菌的新的含100 mg/L麦草畏的无机盐培养基，标记后继续振荡培养。7天后继续检测麦草畏的利用率同时传代，以相同条件培养，连续重复5次。

1.1.3 稀释涂布 经过多次重复尝试，除了最初的烟草地样品的富集液，传代培养基均没有发现明显的吸光度变化，再次将烟草地样品进行传代接种依旧没有明显变化。于是将最初的烟草地富集液与最终的传代培养基进行涂布。将培养基按梯度稀释到10-7倍，各取10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，五个梯度进行涂布分离，涂布到麦草畏浓度为200 mg/L的固体无机盐培养基，将涂布好的平板放到30℃恒温培养箱培养5天，观察是否形成单菌落。选取两株清晰的单菌落接种到LB培养基进行培养。并将其命名为Dicamba-1和Dicamba-2。

1.1.4 紫外检测 选择清晰的单菌落，将分离得到的两种菌接种到麦草畏浓度为100 mg/L的液体MM培养基中进行培养。每天对其进行吸光度的检测，持续5天，发现吸光度并没有发生变化，得出该两种菌为耐药菌不具有降解麦草畏的能力。

1.2 菌种鉴定

将在LB培养基中培养的菌种划线到固体LB培养基上观察菌落形状、大小、颜色、透明度、边缘整齐度、湿润度和表面隆起等特征，进行革兰氏染色。再通过测定16S rRNA的序列确定它的遗传学地位。

1.2.1 革兰氏染色

（1）涂片固定。

（2）草酸铵结晶紫染1分钟。

（3）自来水冲洗。

（4）加碘液覆盖涂面染约1分钟。

（5）水洗，用吸水纸吸去水分。

（6）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20秒后水洗，吸去水分。

（7）蕃红染色液（稀）染2分钟后，自来水冲洗.干燥，镜检。

1.2.2 用CTAB法提取总DNA

CTAB作为一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，与核酸形成复合物，可使核酸沉淀出来。

（1）吸取2 mL经过扩大培养后的菌液至离心管，12000 rpm 高速离心后去上清，来收集菌体。

（2）加入3~5 mL TEN 洗涤，再经过高速离心后，重悬于2 mL TEN中，洗去杂质。

（3）加入15 μL溶菌酶，在55℃恒温水浴2小时，来破碎细胞。

（4）加入200 μL SDS 溶液后再55℃水浴30 min 来使得蛋白沉淀析出。十二烷基硫酸钠（SDS）是一种常用的离子型去垢剂，可使细胞膜崩解，与膜蛋白的疏水部分进行结合并使其与膜分离，高浓度的SDS还能够破坏蛋白质中的离子键和氢键等非共价键，甚至可以改变蛋白质的构象。

（5）加入15 μL 蛋白酶K 溶液，65 ℃水浴几小时至溶液澄清，以除去组蛋白。

（6）加入500 μL 饱和NaCl 和150 μL CTAB/NaCl 溶液，65℃水浴10 min，12000 rpm，离心5 min，将CTAB-核酸的复合物与蛋白、多糖类物质分开。

（7）再在其中加入等体积的酚:氯仿，抽提1~2 次12000 rpm 离心5 min，至上清中不含蛋白残留物，收集上清。