（8）加入0.6 倍体积的异丙醇，混合均匀，室温或-20℃静置15 min，DNA 以白色絮状物析出。

（9）DNA析出后以12000 rpm 离心5 min 取沉淀。

（10）用70%乙醇洗涤沉淀去除异丙醇，在室温下待乙醇挥发，后溶于100 μL TE 中。

1.2.3 PCR扩增

PCR 原理：

（1）DNA常为双链，首先，我们需要把它进行解链，我们设置的高温，刚好能够使得DNA双链解体，从而产生两条单链，让引物结合上去，达到复制的目的。约94~98℃，用3到5 min即可。

（2）在第二步循环中，第一次的高温是进行预变性，在每一次的开链中都需要在进行一次变性，从而达到开链的目的。预变性同样是94~98℃，时间控制在30 s到2 min之间，根据片段不同长度而不同。

（3）在第三步循环中，我们进行退火，使得温度控制在引物和模板链刚好能够结合的温度使得引物和模板链进行结合，温度约为37~70℃。

（4）第四步延伸，在引物结合在模板上进行合成，复制得到引物起始和模板链尾部的新片段， 温度约为72℃。Taq酶的活力是1000 bp/min，16S rRNA基因约为1.5 kb，所以时间约为90 s。

在多次循环以后，得到的片段大多是两个引物控制的部分。即目的片段。在第二步到第四步的过程中每次经过解链，引物结合目的片段，延伸，这三个过程，就新生成一次的目的片段，所以按照推测，PCR产物应该是成对数增长的。但是由于受到酶的活力和反应体系等的限制，因而不能保证每一次都能够完全反应，所以PCR产物的增长曲线，实际上更接近于细菌的增长曲线。

（5）第五步进行补齐延伸，由于酶的活力并不是稳定的，我们的条件也不一定能够达到标准的反应条件，所以酶的作用效果并不一定能够达到最好的情况，所以最后设置了约为10 min的补齐延伸，为了让得到产物有更好的完整性。

本实验使用细菌16S rRNA的通用引物，即：

正向引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′

反向引物：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′

PCR扩增体系（50 μL）：

2×DNA mix 25 μL

正向引物 1 μL

反向引物 1 μL

DNA模板 1 μL

ddH2O 22 μL

PCR扩增程序：

首先95℃预变性5 min；然后94℃变性0.5 min，55℃退火0.5 min，72℃延伸1.5 min，这个过程设置30个循环；最后72℃彻底延伸10 min。PCR扩增结束后，用0.75%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，确定目的条带。

1.2.4 PCR产物回收 制备0.75%琼脂糖凝胶，取2 μLPCR 产物混合10×的Loading Buffer，加到点样孔，在1×TAE 电泳缓冲液中，电压120 V，电泳30 min。取出凝胶用EB 染色10 min，在紫外凝胶成像仪中观察条带。参照凝胶回收试剂盒说明将凝胶成像系统中约1.5 kb 处的条带切胶回收：

（1）称重加入等体积Binding Buffer，58℃水浴至凝胶融化。

（2）一次取700 μL 加到凝胶回收柱中，10000×g 离心1 min，弃滤液。

（3）加300 μL Binding Buffer，10000×g 离心1 min，弃滤液。

（4）加700 μL Wash Buffer，11000×g 离心1 min，弃滤液。再重复一次。

（5）11000×g 离心1 min，结合柱晾干几分钟。

（6）加入30~50 μL ddH2O 或Elution Buffer，37℃放置几分钟，12000 rpm 离心1min。

1.2.5 TA克隆 酶连反应（体系10 μL）：

PCR回收产物 5 μL

T4 ligation Buffer 1 μL

pMD19-T Vector 1 μL

T4 DNA Ligase 0.5 μL

ddH2O 2.5 μL

16℃水浴12小时。完成后进行测序，TA克隆能够增加测序结果的准确性。

1.2.6 构建进化树 将所得到的菌株的16S rRNA序列上传至EzBioCloud网站，在网站中与正式命名的模式菌株的16S rRNA序列进行比对。根据EzBioCloud网站的比对结果，从中选取相似性较高的多种株细菌的16S rRNA，保存并下载序列为Fasta格式后导入到MEGA7.0中，用Neighbour-Joining method别构建菌株系统发育树，Bootstrap Value设定为1000，模型选择Kimura 2-Parameter model。