近年来鸡传染性腺胃炎对养鸡业的危害较为严重，本人实习所在的肉鸡养殖场更是受到了该病的侵扰。因此，本研究通过生产数据分析、临床观察、病理剖检，并采集病料进行实验室检测，由传染性因素入手，对该肉鸡养殖场鸡群的鸡传染性腺胃炎的病因进行了初步探究。在实验室中利用SPF鸡胚分离培养，血凝实验以及RT-PCR方法对病料进行病原分离检验[9-11]。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  病料 从江苏省某肉鸡养殖场采集病鸡腺胃与肌胃组织（添加生理盐水并置于-20℃环境保存）。

1.1.2  主要试剂 SPF鸡胚， MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0(Takara)，HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Vazyme)，鸡新城疫病毒阳性血清，1％红细胞，肝素钠抗凝剂，PBS缓冲液。

1.1.3  主要仪器 PCR仪(Takara)，电泳槽(Bio-rad)，凝胶成像系统(Tannon)，高速冷冻离心机(Eppendorf)，DK-8D型电热恒温水槽，隔水式恒温培养箱

1.2  方法

1.2.1  SPF鸡胚接种

①接种前的准备，将鸡腺胃组织加入PBS进行研磨成匀浆，并置于离心机中进行5000r/min转速下离心五分钟，取上清在超净台中用滤器过滤细菌。②照蛋以铅笔划出气室、胚胎的位置。③用锥子在酒精灯火焰烧灼消毒后，在气室顶端和气室下沿无血管处各钻一小孔，随后利用注射器吸取过滤后的上清以及鸡新城疫病毒阳性血清，针头从气室下沿小孔处插入，深1.5cm，即已穿过了外壳膜且距胚胎有半指距离，注射量0.1mL。注射后以石蜡封闭小孔，置37.5℃恒温箱中直立孵育。

1.2.2  SPF鸡胚观察 接种24h后，每天照蛋2次，观察是否可见清晰的血管，明显的胎动，以及血管网是否丰满。

1.2.3  1%红细胞制备

①由鸡翅下静脉无菌采取抗凝血10ml。

②1000r/min离心5min，吸弃上清液体及白细胞层。

③加入适量PBS重悬清洗，1000r/min离心5min，吸弃上清液体及白细胞层。

④重复前一步骤2次。

⑤最后一次吸弃上清后沉淀即为红细胞，吸取1ml红细胞加入99ml PBS重悬即制得1%红细胞悬液，于4℃保存。

1.2.4  血凝实验

①用PBS（生理盐水）铺板：采用50μL体系进行试验。调节移液器至25μL，吸取PBS缓冲液加入96孔血凝板中。

②倍比稀释：吸取25μL待检样品（为收集的鸡胚尿囊液）依次加入第1纵排孔中，吹打15下后吸取25μL再加入第2纵排孔，再吹打15下，吸取25μL加入第3纵排孔中，依次类推，直至第11纵排孔，吹打混匀后吸25μL后连同吸头一起弃去，最后一纵排为阴性对照。每块平板的第一横排均为鸡新城疫病毒阳性血清对照。

③加红细胞：加1%红细胞，每孔25μL，然后置于37℃温箱反应40分钟，观察结果。

1.2.5  引物 根据病毒基因组序列，IBV AF193423和REV GQ375848,设计了如下引物