Cirsium maackii-type2 杭州临安 X.F. Jin s.n.

Cirsium maackii-type2 杭州临安 X.F. Jin & T.T. Yu 3207

Cirsium maackii-type2 杭州临安 X.F. Jin & T.T. Yu 3207

Cirsium maackii-type2 温州文成 Z.H. Chen WCT-001

Cirsium maackii-type2 温州文成 Z.H. Chen WCT-004

Cirsium maackii-type2 宁波鄞州 X.F. Jin 3210

Cirsium maackii-type2 宁波鄞州 X.F. Jin 3210

Cirsium maackii-type2 宁波奉化 X.F. Jin 3212

Cirsium chinense 杭州淳安 H.W. Zhang s.n.

1.1.2. 扫描电镜材料来源

用于扫描电镜观察的叶片、茎干等材料取自腊叶标本（表2）。以上所用标本均保存于杭州师范大学标本馆（HTC）。

表2 材料来源信息（扫描电镜）

物种 采集地点 标本

Cirsium maackii-type1 杭州临安 X.F. Jin & T.T. Yu 3208

Cirsium maackii-type2 金华磐安 Z.L. Chen s.n.

Cirsium maackii-type2 金华磐安 X.F. Jin & T.T. Yu 3202

Cirsium maackii-type2 杭州临安 X.F. Jin & T.T. Yu 3207

Cirsium maackii-type2 温州文成 Z.H.Chen WCT-001

Cirsium maackii-type2 宁波鄞州 X. F. Jin 3210

Cirsium maackii-type2 宁波奉化 X. F. Jin 3212

1.2. 实验方法

1.2.1. 植物总DNA的提取

取出约30 mg中性硅胶干燥保存的植物叶片，用剪刀将其剪碎放入预冷的钵体中，加入液氮充分研磨成粉末状固体，迅速转移自1.5 ml的离心管中，使用TIANGEN植物基因组DNA提取试剂盒提取植物叶片总DNA，具体操作步骤如下：

1.将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700 μl 65℃预热缓冲液GP1的离心管中（实验前需在预热的缓冲液中加入巯基乙醇，以保证浓度为0.1%），迅速颠倒多次混匀后，将样品置于65℃中水浴加热20 min，5 min颠倒离心管一次，使样品混合均匀。

2.加入700 μl CHCl3后混匀，12000 rpm离心5 min。

3.用移液枪将上一步所得的水相转移至新离心管中，加入700 μl缓冲液GP2，缓慢颠倒，混匀。

4.将上一步混匀液体转入吸附柱中，12000rmp离心30 s，将废液弃去（分两次加入）。

5.往吸附柱加入500 μl缓冲液GD，12000rmp离心30 s，将废液弃去，吸附柱放回收集管。

6.往吸附柱加入600 μl漂洗液PW，12000rmp离心30 s，将废液弃去，吸附柱放回收集管。

7.重复上述操作8。

8.将吸附柱置于收集管中，12000rpm离心2 min，将废液弃去。吸附柱放在室温下15 min干燥吸附材料中残余的漂洗液。

9.在一个干净的离心管中转入吸附柱，用移液枪向中间位置滴加50-100 μl的洗脱缓冲液，室温下放置2-5 min，12000rmp离心2 min，收集溶液至离心管，做好标记，放置于-20℃冰箱储存。

1.2.2. PCR扩增与产物检测

cpDNA进化路线独立，而且叶绿体基因组中不同的基因片段在不同的植物类群中具有不同的突变速率[11]因此研究不同的植物类群时，最好通过预实验对基因片段进行筛选，选出适合该类群的基因片段。

将浙江野蓟的两种类型的15个个体进行5对非编码片段（atpB-rbcL，trnL-F，ITS，matK、psbA-trnH）进行PCR扩增，扩增产物送往Sangon Biotech生物公司进行测序，寻找分化片段，根据测序结果trnL-F，ITS这两对引物存在着较高的遗传变异。因此本次实验将选取trnL-F和ITS引物对所有个体材料进行PCR扩增和测序。引物由Sangon Biotech生物公司合成，引物名称和序列见表3，引物同样用于PCR产物的直接测序[12]。

PCR反应体系总体积为25 μl，具体成分见表4，PCR扩增程序见表5，在 2700 Thermal Cycler型PCR扩增仪上完成扩增反应[12] 。

表3 PCR反应体系

Total 25 μl

Primer1（10μM） 1 μl

Primer2（10μM） 1 μl

2xEasyTaq pcr SuperMix(+dye) 12.5 μl

Taq酶 0.0.3 μl

DNA模版 1 μl

ddH2O 9.2 μl

表4引物名称和序列

扩增序列 引物名称 引物序列(5’-3’)