ITS ITS-1 AGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGG

ITS-4 TCCTCCGCTTATTGATATGC

trnL-F trn-c CGAAATCGGTAGACGCTACG

trn-f ATTTGAACTGGTGACACGAG

表5叶绿体和核基因片段PCR扩增反应程序

引物类型 步骤 温度℃ 时间 目的

叶绿体片段

（） Step  1 94 3 min 模板预变性

（Chloroplast） Step  2 94 1 min 模板变性

Step  3 55 1 min 退火

Step  4 72 1 min30s 延伸

Step  5 go to Step 2 37cycles

Step  6 72 7 min 延伸

Step  7 4 ———— 保温

核基因片段

Step  1 94 3 min 模板预变性

（Nuclear） Step  2 94 30 s 模板变性

Step  3 55 30 s 退火

Step  4 72 1 min 延伸

Step  5 go to Step 2 35 cycles

Step  6 72 10 min 延伸

Step  7 4 ———— 保温

PCR 扩增反应结束后，采用的是1x TBE配置的1.5%低熔点琼脂糖，待其凝固后，将3μl PCR扩增产物，加入到点样孔中。电泳电压为120 V，时间大约20 min，电泳缓冲液为1x TBE，使用柯达凝胶图像系统对胶块进行观察并摄影记录，观察到的扩增条带明亮，清晰。

1.2.3. 序列编辑和系统发育分析

PCR产物（未纯化）送往上海生工工程Sangon Biotech生物公司进行双向DNA测定。测序仪器为3730XL DNA Analyzer，测序选用的试剂为BigDye terminator v 3.1。测序引物与扩增所用引物相同。将得到的测序结果，序列的拼接、比对用ClustalX 1.83软件，并加以手工校对。排好的序列用PAUP* 4.0b10构建最大简约树（Maximum Parsimony, MP），最大简约树用启发式搜索（heuristic search），1000次随机序列加入，TBR枝长交换。采用1000次重复取样自展分析（Bootstrap）评估系统树的分支的自展支持率[11]。