二、研究的基本内容和拟解决的主要问题

1. 本课题主要是研究内容是探讨生物钟对蝌蚪行为的调控作用，并研究生物钟调控行为变化的可能生物学机制。

2. 主要从以下几个方面去研究：

（1）使用不同的光照时间处理发育过程中的蝌蚪，检测蝌蚪对光点刺激的回避反应情况，观察改变光照时间是否调节行为学变化。

（2）用不同光照时间处理蝌蚪，并提取其视顶盖蛋白，用H3K9、H4K12和HDAC1等抗体测其蛋白表达量，和正常光照时间的蝌蚪进行对比，分析生物钟变化对神经系统中枢蛋白表达的影响。

（3）分析行为学变化和蛋白表达量的关系，研究生物钟变化对神经环路的影响和蝌蚪行为变化的可能机制。

3.解决问题：

（1）不同光照时间对蝌蚪的光点刺激的回避反应情况。

（2）经过不同光照时间处理后，用H3K9、H4K12和HDAC1等抗体检测蝌蚪视顶盖蛋白表达量的区别。

三、研究方法及措施

1.研究方法：

在成年雌雄蛙体内分别注射HCG，雌性爪蟾注射1000单位HCG,雄性爪蟾注射500单位HCG，放在一个水箱内进行配对。受精的卵母细胞孵化变为34期后开始选择活动状态良好的蝌蚪100只作为实验材料备用。

随机分成3组，设置实验组和对照组。其中一组对照组，其余两组为实验组，各组24只蝌蚪，其中对照组为12h光照和12h黑暗，实验组一为20h光照和4h黑暗。实验二为4h光照和20h黑暗。培养至37期左右对其进行onedot检测，连续检测5天后提取其蛋白做Westernblot。观察蝌蚪行为学和蛋白表达量，以探讨不同光照对蝌蚪生长发育的影响。

2.具体措施：

（1）蝌蚪行为学的测量：从34期连续培养至47期以6只为一组分别放于行为学仪器中测onedot分别观察和记录每组蝌蚪对光点刺激的回避反应情况。

（2）蛋白表达量的检测Westernbolt：分别提取测量行为学的第二天、第四天和第五天的蛋白做好标记，其中具体步骤：

1）将蝌蚪麻醉后在显微镜提取蛋白放于RIPA+PMSF中，并至于冰上。

2）以研磨棒将视顶盖匀浆，并静置30-60min。

3）离心，12000rpm,5min，弃上清。

4）制备分离胶。

5）待分离胶凝固后倒掉上层异丙醇，并用滤纸吸干残留异丙醇，加入2ml浓缩胶（注意防止气泡产生），并插入梳子。

6）将蛋白样品点样。

7）上样跑胶，电压90V，时间20-30min；待样品跑至浓缩胶与分离胶交界处，将电压改为120V，1h。

8）转膜，将转膜装置置于冰内，电泳100V，时间60-70min。

9）用1xTBST配制3-5%脱脂奶粉，室温封闭2h。

10）用脱脂奶粉稀释一抗，孵育4摄氏度过夜。

11）TBST摇床上洗5minx3次；用脱脂奶粉稀释二抗，摇床上常温孵育1.5h；TBST摇床上洗5minx3次。

12）放入成像仪中，加入1:1混合的ECC，设置相应的曝光参数，显像。

四、研究工作的步骤与进度

1.2015.6.13-2015.7.22：

熟悉实验室的规章制度，掌握实验需要的相关技术，查阅有关文献了解爪蟾的生活习性；并查阅生物钟的相关文献，制定实验方案。

2.2015.7.30-2015.8.15：

掌握使用爪蟾进行配对产蝌蚪的方法，并学会区分蝌蚪不同发育时期的外形特点。

3.2015.8.16-2015.8.30：

掌握测定爪蟾行为学的方法和Westernblot技术以及视顶盖蛋白的提取技术。

4.2015.9.25-2015.11.30：

按照制定的实验方案进行实验，首先选取蝌蚪对其按照不同条件进行培养，并每天进行行为学的检测，记录每天的行为学指数。利用不同批次的蝌蚪重复实验三次以上，分析数据。

5.2015.12.1-2015.12.30：

对培养一个多星期的蝌蚪提取其视顶盖蛋白，通过Westernblot测定不同实验组蛋白表达量的差别,分析实验数据。