3.4.3冰冻切片和免疫荧光技术 11

4.实验结果 12

4.1小鼠的基因型鉴定 12

4.2观察Gata3敲除后对毛细胞形态和结构的影响 13

4.3实验结论 16

5.实验总结与讨论 16

参考文献 17

致谢 19

1.引言

1.1内耳结构和毛细胞

内耳由于结构复杂，又称为迷路。哺乳动物的耳一般分为外耳、中耳和内耳组成。内耳处于小脑后方，由前庭（Vestibula）和耳蜗（Cochlea）两个部分组成，行使听力功能，并且起到传递信息和维持平衡的作用。耳蜗的核心组成是柯蒂氏器（Organ of Corti,OC）和螺旋神经节（spiral ganglion neuron,SGN），在哺乳动物中，声音和平衡知觉是由内耳所介导的，内耳是由耳蜗和前庭系统组成的复杂结构。耳蜗听觉的核心组件是包含毛细胞和支持细胞的器官，哺乳动物耳蜗毛细胞有两种解剖学上和功能上不同的类型：内毛细胞、外毛细胞（OHCs和IHCs）。内耳的功能非常重要，功能有维持机体平衡，对声音接受后分析加工，即将声音转变为神经冲动，传递声音信息，而后将信息从蜗后传入到大脑皮层的听觉中枢。

细胞为感受声波刺激的感觉上皮细胞.分有内、外毛细胞，内毛细胞在内柱细胞的内侧排成一列,外毛细胞有3-5列。一般是三排外毛细胞，外毛细胞的底端分别由内指和外指细胞承托着,并与螺旋神经节细胞的周围突形成突触联系7-10。位于内耳前庭和耳蜗的感觉上皮区域（Sensory epithelium）由感觉毛细胞和非感觉支持细胞（Nonsensory support cells）组成，毛细胞和支持细胞由听囊腹侧区域的上皮原始细胞分化而来。在胚胎发育的过程中，上皮原始细胞发育成前感觉原始细胞；前感觉原始细胞进一步分化成前庭和内耳感觉区域；区域内的细胞最终形成毛细胞和支持细胞，两种细胞的特化结构与上皮细胞有很大的差异。前感觉区域中，毛细胞是最早特化出来的细胞类型。最早的毛细胞由椭圆囊上皮或者是耳蜗管的中间区域的细胞分化而来。随着发育过程的继续新的毛细胞开始进行有规律的分化，支持细胞跟毛细胞有相似的发育规律，根据细胞种类和内耳的区域会有延迟。如果在临床上哺乳动物的耳蜗也能实现毛细胞的再生，将为人类的神经性听力损失提供一个潜在的治疗方法。毛细胞的缺失会诱导非感觉支持细胞的分化和转移，支持细胞将会改变它的基因表达，不通过有丝分裂转变成毛细胞，或者是一个支持细胞分裂形成两个母细胞然后生成新的替代的毛细胞，耳蜗的功能和结构就会得到基本的恢复。但是，毛细胞的再生是有其时间和数量的限制的，再生的毛细胞的数量是刚刚好能替代缺失的毛细胞的数量的，也跟被转化的支持细胞的数量是一致的。鸟类中存在的这一现象提高了对人类的毛细胞再生的信心。

科学家们希望，他们能使用这种细胞为耳聋患者进行细胞移植能够解决耳聋疾病，取代神经性耳聋患者已受损的毛细胞和神经细胞11-15。神经性耳聋在我们的生活中是最常见的，占耳聋患者总数的90%，患神经性耳聋的患者超过600万人。转录因子Gata3是耳蜗发育过程中非常重要的调控因子，但是它在螺旋神经节细胞、毛细胞和支持细胞发育完成之后，对于维持这些细胞的存活和功能的作用或影响还不是很了解。所以这篇论文主要研究的是转录因子Gata3在小鼠耳蜗中对维持毛细胞功能的作用和其在成年小鼠耳蜗的功能和相关的作用机制，使我们能具体的研究耳聋性疾病的发病原理和病理过程。毛细胞对耳蜗来说特别重要，不管在那个方面如果毛细胞受损的话都会影响整个耳蜗的功能和形态，会造成耳聋等疾病，我们主要研究小鼠的耳蜗全部生成以后，条件性敲除Gata3基因观察对毛细胞是一个什么样的作用，会不会对毛细胞或支持细胞产生影响，它们的数量和结构会不会发生变化。、