大曲作为白酒发酵酿造的糖化发酵剂，富含多种酶类和微生物，其中蛋白酶类是重要的一种，其主要来源于微生物产生。本研究以宋河中高温大曲为原料，筛选高产蛋白酶菌株，并对该菌株的产蛋白酶的发酵性能和粗酶液的酶学特性进行研究，以期对蛋白酶的纯化和酶制剂的生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料、仪器及试剂

1.1.1 实验试材

  宋河中高温大曲；取自河南省宋河酒业股份有限公司。

1.1.2 主要培养基

产酶发酵培养基：豆饼粉3 g，玉米粉4 g，麸皮4 g，磷酸氢二钠0.4 g，磷酸二氢钾0.03 g，水100 mL，pH值7.2。玉米粉培养基：玉米粉4 g，蛋白胨0.01 g，葡萄糖0.1 g，水100 mL。麸皮培养基Ⅰ：麸皮4 g，硫酸铵0.5 g，磷酸氢二钾0.02 g，七水硫酸镁0.01 g，水100 mL，pH值7.0。麸皮培养基Ⅱ[11]：麸皮12.5 g，豆饼粉3 g，麦芽糖5 g，硫酸镁0.6 g，硫酸铵0.5 g，磷酸氢二钾0.5 g，水160 mL。牛肉膏蛋白胨培养基和酪素培养基[10]。

以上所有培养基灭菌条件：121℃，0.1 MPa，20 min。

1.1.3 试剂  

碳酸钠溶液、三氯乙酸溶液、盐酸溶液、氢氧化钠溶液、福林试剂、磷酸缓冲液、1％酪蛋白溶液、L-酪氨酸标准溶液等。

1.1.4 仪器设备

电子天平（型号AL204）（梅特勒-托利多公司）；型超净工作台（型号JJ-CJ-2FD）（苏州市金净生产）；101-1 型电热鼓风干燥箱（北京科伟永兴生产）；电热恒温水浴锅(HWS24)（上海一恒生产）；DHP-9162 型电子恒温培养箱（上海一恒生产）；海尔冰箱(BCD-215KCM)（青岛海尔生产）；ZHWY-2102C型双层恒温培养振荡器（上海智城生产）；SYQ-PSX-280B型手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器（上海申安生产）；V-5000 型可见分光光度计（上海元析生产）。

1.2 实验方法

1.2.1 中高温大曲产蛋白酶菌的筛选

1.2.1.1 产蛋白酶菌株的分离

将中高温大曲粉碎，无菌条件下取10 g粉碎样品加入到盛有90 mL无菌水三角瓶中，置电炉煮沸10 min，以富集产蛋白酶芽孢菌，然后将三角瓶放置在摇床中振荡 30 min后充分混匀静置，将 1 mL上清液装入含有 9 mL无菌水试管，做梯度稀释。取10-5、 10-6、10-7梯度稀释液0.5 mL涂布在酪素培养基平板上，37℃恒温倒置培养24 h，挑选具有明显特征的产蛋白酶单菌落进行编号并纯化24 h，然后转接试管斜面低温保藏备用。