原始卵泡构成女性生殖寿命期间存在的雌性生殖细胞的休息池。在任何时候，一个小群体被激活生长，随着体细胞标记的逐渐增长的初级卵泡阶段转变为立方体并增殖以完全包围正在生长的卵母细胞。体细胞继续增殖并在卵母细胞周围形成越来越多的层，从细胞间质中募集细胞以包围卵泡，并且随着卵泡大小增加，在颗粒细胞层内形成流体填充的斑块以形成胃窦腔[19]。

颗粒细胞在卵巢组成中是一种关键的细胞组分，在卵泡中起着提供营养物质和调节的关键作用[20]。卵泡颗粒细胞的增殖和分化会对原始卵泡产生重要的影响，如直接影响其的生长启动、增殖、分化、闭锁、发育排卵到黄体的形成等过程。

另外，小鼠卵巢颗粒细胞体外培养技术已相对成熟，有些研究对培养方案进行了优化。如前期小鼠卵巢颗粒细胞的体外培养的研究反映出FSH和EGF能促进小鼠卵巢颗粒细胞的增殖，且在卵巢颗粒细胞上发现了部分的干细胞特性[20]。

随后进行的小鼠卵巢颗粒细胞体外培养的优化研究结果显示，15%血清含量的DMEM (高糖)培养基总体培养效果最佳，较适合作为培养颗粒细胞的培养用液[18]。

1.3 研究目的与研究意义

1.3.1 研究目的

卵巢功能早衰是化疗药物治疗后妇女常见的不良反应，其结果是影响生育和非生育健康，如造成骨质疏松症和心血管疾病。发生卵巢早衰的风险由化疗方案，患者年龄以及药物剂量等决定。

尽管人们认识到化疗可能导致卵巢卵泡丢失从而导致卵巢早衰，但发生这种情况的确切机制并不确定[21]。

化疗药物多柔比星毒性的作用机制研究对寻找潜在治疗方法以保护卵巢免受化疗引起的损伤非常重要。

通过该项研究，对多柔比星的卵泡颗粒细胞毒性有了初步的认识，从而更好的认识多柔比星对颗粒细胞毒性的作用机制，为阿霉素在临床上的合理应用提供理论依据。

1.3.2 研究意义

女性生殖毒性，如卵巢早衰是癌症化疗引起的不良副作用，尤其是对于年轻患者。研究表明，体内阿霉素治疗导致小鼠卵巢（主要是次级卵泡）内的滤泡储备显著丧失，以及原始卵泡和原发卵泡数量下降。所有卵泡的群体都受到损伤，最为显著的是次级卵泡。众所周知，这种性腺毒性作用可导致生育力下降，并导致人和动物不育。当原始卵泡数量过少时，女性的生殖功能下降，而原始卵泡的保留减少会减少原始卵泡中所含卵母细胞的供应，卵母细胞数量在出生前是恒定的。

卵巢早衰的一个重要诱因就是原始卵泡数量的丢失。很多研究显示，卵泡闭锁的根本原因是由于颗粒细胞的凋亡，而卵巢颗粒细胞的凋亡会引发一系列后续的不良反应，如引起卵泡闭锁，引发卵泡发育后期如窦状卵泡及排卵前卵泡死亡闭锁[18]。

通过该项研究，可以对多柔比星的卵泡颗粒细胞毒性有初步的认识，对其卵巢毒性作用机制有更深入的了解，以期为阿霉素的临床用药方案提供理论研究的依据，尽量避免多柔比星用药带来的毒副作用。

1.4本课题研究的主要内容

本课题主要研究化疗药物多柔比星引起的卵巢毒性对雌性ICR小鼠卵泡颗粒细胞发育的影响。本课题将从青春期前PND 21-23 F1代雌性仔鼠身上解剖获取卵巢颗粒细胞，并对颗粒细胞进行体外培养使之能用于后续的研究。随后，通过CCK-8试剂检测确定多柔比星在体外培养的小鼠颗粒细胞上的IC50，从而确定多柔比星的作用浓度。最后采用DAPI染色法检测多柔比星引起的细胞凋亡的形态特征和凋亡的细胞数量；同时通过caspase-3/7荧光探针定量检测颗粒细胞的凋亡情况。

1.5主要的实验原理