本实验采用以人重组IL6R为免疫原，分别免疫小鼠及兔，采用杂交瘤技术制备抗IL6R鼠单抗，通过纯化兔血清制备抗IL6R兔多抗；将重组蛋白IL6R进行生物素化标记，通过阻断抑制其与重组IL6的结合测定抗体的中和活性；利用单抗和多抗建立ELISA双抗夹心法定量或定性检测样本中IL6R水平的方法，来制备高灵敏度的抗人白介素6受体（IL6R）鼠单克隆抗体及兔多克隆抗体，并进行鉴定，同时筛选具有中和活性的鼠单克隆抗体；通过多抗和单抗配对，制备高灵敏度的人IL6R酶联免疫检测试剂盒。本实验以高亲和力和高纯度的抗体为基础，筛选具有中和活性的抗体，同时选用具有生物活性的重组人IL6R为检测标准品，建立了检测天然IL6R的ELISA方法，该方法方便易行，检测灵敏度和准确度高、特异性强、能够同时快速检测大批样本，成本低，可靠性强，预计将在IL6R相关基础和临床研究中发挥重要作用。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物、细胞及重组蛋白

SPF级Balb/c小鼠，雌性，6-8周龄，由北京维通利华实验动物中心提供；新西兰大白兔，清洁级，体重2.2kg以上，由北京维通利华实验动物中心提供；小鼠骨髓瘤细胞SP2/0由本实验室保存；重组人IL6R、IL6均由本公司制备。

1.1.2主要试剂

RMPI1640培养基、胎牛血清购自GIBCO公司；弗氏完全佐剂（CFA）、弗氏不完全佐剂（IFA）、HAT、聚乙二醇（PEG）、生物素（Biotin）、辣根过氧化物酶标记的链亲和素购自VECTOR，抗体亚型鉴定试剂盒均购自Sigma公司。

1.2实验方法

1.2.1人IL6R蛋白小鼠单克隆抗体的制备

1.2.1.1动物免疫。采用Balb/c小鼠作为免疫动物，以具有生物活性的重组人IL6R蛋白为免疫原，免疫剂量为50µg/只，首次免疫将免疫原与等量的完全弗氏佐剂充分乳化，腹部皮下多点注射，间隔2周取相同剂量免疫原与等体积不完全弗氏佐剂制成乳化剂，加强免疫两次。取血清效价高的小鼠腹腔加强免疫一次，4天后取脾细胞进行融合。

1.2.1.2细胞融合和克隆化。取免疫小鼠脾细胞，按5：1比例与SP2/0骨髓瘤细胞混合，利用聚乙二醇法进行融合，获得杂交瘤细胞。采用重组人IL6R蛋白作为包被抗原，用ELISA法测定细胞上清液，选取阳性孔通过有限稀释进行克隆化，直至得到稳定分泌抗IL6R特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株A001和A002。

1.2.1.3单克隆抗体的生产与纯化。选取筛选阳性杂交瘤细胞株，利用培养瓶进行细胞培养，收集细胞培养上清，利用蛋白A进行亲和纯化，分装后于-20℃低温保存。

1.2.2人IL6R蛋白兔多克隆抗体的制备

采用新西兰大白兔作为免疫动物，以重组人IL6R蛋白为免疫原，免疫剂量为500µg/只，首次免疫将免疫原与等量的完全弗氏佐剂制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，此后每间隔2周取相同剂量免疫原与等量不完全弗氏佐剂制成乳化剂，

加强免疫四次，测定血清效价，心脏取血，经蛋白A和IL6R蛋白抗原亲和纯化

后得到纯化的多克隆抗体。

1.2.3抗体基础鉴定

1.2.3.1抗体浓度及纯度的鉴定。采用BCA法检测抗体浓度，用还原SDS-PAGE检测抗体纯度。

1.2.3.2单抗灵敏度的检测。采用间接ELISA方法，将重组人IL6R蛋白用pH为9.6的碳酸盐缓冲液稀释成0.05、0.025、0.0125、0.0063、0.0031、0ug/mL，用100uL/孔包被酶标板，抗体1ug/mL加样，然后加入辣根过氧化物酶标记的二抗显色。通过450nm的吸光值减去3倍SD大于空白值加3倍SD确定抗体的检测限。

1.2.3.3单抗的特异性的检测。采用间接ELISA方法，将人细胞（293细胞）裂解液5μg/mL包被酶标板，检测单抗的特异性。

1.2.3.4抗体亲和力的测定。使用Fortebio公司的Octet生物分子相互作用分析仪进行IL6R单克隆抗体的亲和力测定。