Caspases是细胞进入程序性死亡的特异性标志,已经越来越受到重视［4］。目前认为其发挥作用必须在激活物的作用下将其激活为活性形式,然后作用于相应的底物［5］,引起的变化包括:①阻遏细胞周期循环;②破坏细胞平衡状态及修复机制;③使细胞从周围的组织结构中脱落;④使维持细胞结构的物质解体。Caspase一经激活裂解其作用底物,细胞凋亡便不可逆地进入实施阶段。其中以Caspase 3较为引人注目［6］。Caspase 3在Caspases家族中属于凋亡效应亚类的Caspase蛋白酶,执行剪切细胞结构蛋白的作用,直接使细胞发生凋亡,是细胞凋亡过程中最重要的终末执行酶［7］。所以检测Caspase3表达和活性对研究细胞凋亡具有重要意义。

细胞凋亡发生时,水和溶质进入基质,引起线粒体的膨胀,内膜的膨胀导致外膜的破裂,从而释放包括细胞色素C在内的各种蛋白。同时线粒体形成足够大的运输通道,现已发现Bcl-2、Bcl-xL、Bax等在平面脂双层中能形成孔道,在脂质体中Bax能发生寡聚化形成具有高传导性的通道并且激活细胞色素C的释放［8-9］。Bax是细胞凋亡促进基因，Bax的过度表达可拮抗BCL-2的保护效应而使细胞趋于死亡。所以测定Bax，Caspase 3，Cy-c，Bcl-2蛋白的表达对于测定细胞凋亡情况至关重要。

1.材料与方法

1.1材料

1.1.1试验动物和分组

 本试验选择安徽某农牧公司良种猪场饲养的正常发情和受孕的纯种长白经产母猪共 20 头。根据背膘厚度分为 2 组：低膘妊娠组(12-17 mm)母猪共 10 头、高膘妊娠组(20-27 mm)母猪共10 头。

1.1.2饲养管理

 试验猪只按猪场免疫程序进行常规免疫，自由饮水，妊娠期母猪每日 9:00、16:00各饲喂一次，饲喂干粉料，每日喂量 2.5-3.5 kg。哺乳期每日 9:00、14:00、17:30 各喂一次，每日喂量 5.8-6.3 kg。

1.1.3母猪背膘和分组

 测定母猪背膘厚度连续测量 3 次，记录数据。背膘厚度在12-17的定为LBF组，背膘厚度在20-27的定为HBF组。

1.1.4实验材料的准备

a.TUNEL荧光染色检测试剂盒

b.免疫组化染色检测试剂盒

c.SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒

1.2实验过程

1.2.1TUNEL荧光染色检测

 二甲苯中脱蜡5-10分钟。换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5-10分钟。无水乙醇5分钟。90%乙醇2分钟。70%乙醇2分钟，蒸馏水2分钟。滴加20μg/ml不含DNase的蛋白酶K，20-37℃作用15-30分钟。 PBS或HBSS洗涤3次。注意：这一步必须把蛋白酶K洗涤干净，否则会严重干扰后续的标记反应。

1.2.2免疫组化染色检测

 胎盘绒毛组织石蜡切片经水洗、二甲苯脱蜡和梯度酒精脱水后，PBS 洗 3 次，5 min∙次-1；切片放入柠檬酸钠抗原修复液中，煮沸 20 min，自然冷却至室温，PBS 洗 3 次，5 min 次-1；每张切片滴加 2 滴 3%H2O2-甲醇溶液，室温（15～25 ℃）封闭 10 min，PBS 洗 3 次，5 min∙次-1；滴加即用型山羊血清 50～100 µL，室温放置 20 min；滴加Caspase 3 一抗(1:200) 50～100 µL，4 ℃孵育过夜，PBS 洗 3，次，5 min∙次-1；滴加生物素二抗 50 µL，37 ℃孵育 30 min，PBS 洗 3 次，5 min∙次-1；每张切片加 2 滴现配的 DAB 染液，镜下调整染色时间；苏木素复染，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观测并拍照。取适量组织样本剪碎，加入冷的裂解缓冲液，匀浆后在冰上静置15min，吸取上清，取适量上清加入检测缓冲液并加入适量 Ac-DEVD-pNA，在37℃下避光反应1-2小时，然后测定A405,计算Caspase 3活性。

1.2.3.Western blot 检测凋亡蛋白表达水平

 用 RIPA 裂解液（Takara）裂解胎盘绒毛组织样品，提取总蛋白质，提取步骤严格按照 RIPA 裂解液说明书进行。采用 BCA 蛋白浓度测定试剂盒（碧云天）测定每个蛋白样品的蛋白浓度。按照 SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒（凯基）说明书配制浓缩胶和分离胶。在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的 SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液。沸水浴加热 5 min，以充分变性蛋白。冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到 SDS-PAGE 胶加样孔内即可。电泳时在上层胶时使用 60V 低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用 120V 高电压恒压电泳。选用 PVDF 膜进行转膜，从转移夹负极开始，按海绵—滤纸（3 层）—凝胶—PVDF 膜—滤纸（3 层）—海绵顺序组装转移夹，转膜电流为 300-400 mA，转膜时间为 90 min。转膜槽放置在冰浴中进行转膜。转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的孵育盒中，TBST 溶液漂洗 10 min，以洗去膜上的转膜液。加入 Western 封闭液，在摇床上缓慢摇动，室温封闭 60 min。参考一抗的说明书，按照适当比例用 Western 一抗稀释液稀释一抗，立即加入稀释好的一抗，4℃缓慢摇动孵育过夜。回收一抗。加入 TBST 溶液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤 10 min，共洗涤 3 次。参考二抗的说明书，按照适当比例用 Western 二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。立即加入稀释好的二抗，4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。回收二抗。加入 TBST 溶液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤 10 min，共洗涤 3 次。参考相关说明书，使用 ECL 试剂来检测蛋白。压片采用专用的压片暗盒进行。