近20年来，噬菌体展示技术已成为抗体工程中的重要方法，也是测定胞外操作抗体亲和力、特异性和稳定性的有效工具。它最成功的应用是从免疫抗体库、天然抗体库、合成抗体库三种大的类型的抗体库中进行抗体分离[6-7]。而埃博拉病毒(Ebolavirus,EBOV)起源于1976年，在非洲中部苏丹和扎伊尔两国交界一带盛行，是一种能引起埃博拉出血热的新型病毒[8]。随着生物信息学和蛋白质组学理论与技术的逐步发展，蛋白质三维结构预测、分子模拟技术等逐渐完善，噬菌体展示技术将会促进抗体文库构建技术、分子识别及相互作用[9]、酶学机制和生物疫苗[10]研制等应用领域的研究和发展。所以将该技术运用到EBOV抗体的研制中，为有效的治疗埃博拉提供大的帮助，为广大人民群众带来福音。

1.实验材料、仪器及试剂

1.1实验材料

EBOV蛋白原库（由北京义翘神州技术有限公司提供），二抗（M13、Flag），二甲基亚砜（DMSO）（沧州东丽精细化工有限公司），辅助噬菌体，牛血清白蛋白（BSA）（来自盐城赛宝生物科技有限公司）

1.2仪器及试剂

1.2.1实验仪器

表1实验仪器

设备名称 设备型号 品牌 厂家

酶标仪 MULTISKANMK3 Thermo Thermo

洗板机 WELLWASH4MK2 Thermo Thermo

超净台(双人） 哈东联DL-CJ-2N(1类B型) 哈东联 哈东联

全自动隔水恒温培养箱 ZGP-2160 ZHCHEGNG 智诚

双层摇床 智诚ZSD-1270 ZHCHEGNG 智诚

干燥箱 智诚ZHWY-1102C ZHCHEGNG 智诚

涡旋仪 IKAMS3basic IKA IKA

八道移液器 KZ21081 Thermo Thermo

单道移液器 B1430730M Thermo Thermo

PCR仪器 MG96 Longgene 杭州朗基

CaliperLabChip GX/GXII LifeSciences LifeSciences

1.2.2实验试剂

超纯水，CBS，1×TBST洗液，1×PBS洗液，封闭液（分别含3%脱脂奶粉的PBS和含2%牛血清白蛋白的洗液)，二抗稀释剂（含0.5%牛血清白蛋白的洗液），显色液，2MH2SO4，ATK培养基，2YT培养基，ATG培养基，X-blue，ElutionBuffer，Tris盐酸，Amp+，10xPCRBuffer，Sau3AI，rTaq，dNTP，10xH，上/下游引物，染-料胶溶液/Ladder试剂（现配现用）。

2.实验方法

2.1EBOV噬菌体库的淘洗

（1）包被：将EBOV蛋白用CBS稀释成10ug/mL,100uL/w加入酶标板，室温放置4h；弃去包被孔的溶液，340uL/w1×TBST洗涤1次，拍干；然后340uL/w加入封闭液，4°C过夜；满孔洗涤2次，开始淘洗。

（2）淘洗：100uL/w埃博拉噬菌体原库加入到已孵育好的酶标版中，放在37°C摇床中，70r/min振荡2h；再用1×TBST满孔清洗，第一轮淘洗，洗涤6次，根据结果进行2轮淘洗，洗涤8次，若检测没有显示结果，接着向下淘洗，分别洗涤10、12次，每轮淘洗后放到摇床上摇动，每次1min；淘洗完后，1×PBS满孔洗两遍，在吸水纸上拍干。

（3）洗脱：淘洗库的洗脱分两次进行，首先向洗完的孔里加入100uLElutionBuffer，70r/min振荡7min，之后8uL/w加入2MTris-HCl，吸出含有菌液的洗脱液，加入含有5mLXL1-blue的离心管中，37°C孵育30min，完成第一次洗脱。然后在一次洗脱完的孔内再次加入XL1-Blue菌液100uL，静置30min进行第二次洗脱。将两次洗脱液合并，从中取出100uL混合菌液作涂板用。

（4）培养扩增：将洗脱后的菌液直接培养扩增，加入Amp+,250r/min37°C振摇1h。然后加入VCSM13100uL，37°C静置30min，之后加10mLATG培养基，振摇1h。之后4000r/min离心10min，弃上清，用5mLATK培养基将沉淀重悬起来，斜着放入摇床中，过夜振摇。次日每个库各取2管至2mL离心管内，每管吸取1.8mL，11000r/min离心5min之后将上清液对应换至另一新管中，加120uLDMSO，一管进行下一轮淘洗，另一管放入-20°C冰箱内备用。

2.2EBOV噬菌体淘洗库的ELISA检测