[12] Naumoff D G, Dedysh S N. Lateral gene transfer between the Bacteroidetes and Acidobacteria: the case of α-L-rhamnosidases[J]. Febs Letters, 2012, 586(21): 3843-3851

系(教研室)主任：      （签章）     2017 年 1 月 11 日

学院主管领导：        （签章）     2017 年 1 月 11 日

目  录

第一章 绪 论 1

1.1 鼠李糖苷酶的概述 1

1.1.1 鼠李糖苷酶的来源——柚皮酶 1

1.1.2 鼠李糖苷酶基因型 2

1.1.3 α-L-鼠李糖苷酶的提取 3

1.1.4 α-L-鼠李糖苷酶表达系统 3

1.1.5 α-L-鼠李糖苷酶的应用 4

1.2 异槲皮苷的概述 5

1.2.1 异槲皮苷理化性质 5

1.2.2 异槲皮苷的提取 6

1.2.3 异槲皮苷前景应用 6

1.3 生产异槲皮苷工艺概述 6

1.3.1 传统酸解法生产异槲皮苷 6

1.3.2 生物催化转化生产异槲皮苷 7

1.4 绿色荧光标记技术概述 7

1.4.1 绿色荧光蛋白概述 7

1.4.2 其他荧光蛋白 7

1.4.3 荧光标记技术 8

1.4.4 荧光蛋白标记技术研究现状 9

1.5 研究目的和主要内容 9

1.5.1 研究目的及意义 9

1.5.2 主要内容 10

1.5.3技术路线 10

第二章 实验材料和方法 11

2.1 实验药品与仪器 11

2.1.1 实验材料 11

2.1.2 实验试剂 11

2.1.3 实验仪器 13

2.2 融合表达载体的构建 13

2.2.1 鼠李糖苷酶cDNA克隆载体的构建 13

2.2.2 鼠李糖苷酶和荧光蛋白酶融合表达载体的构建 14

2.2.3 构建含rhaB1和EGFP的重组菌株 15

2.3 诱导rhaB1和EGFP表达条件优化 15

2.3.1 诱导时间 16

2.3.2 诱导温度 16

2.3.3 诱导剂浓度 16

2.4 目的蛋白的制备和分离纯化 16

2.4.1 SDS-PAGE法分离纯化目的蛋白 16

2.4.2 Western Blot法分离纯化目的蛋白 17

2.4.3 Ni柱分离纯化目的蛋白 18

2.4.4 酶活力测定 18

2.5 反应新体系的构建 18

2.5.1 产物结构验证 18

2.5.2 立体选择性分析 19

2.5.3 动力学分析 19

2.5.4 构建制备异槲皮苷新体系 19

2.6 统计分析 20

第三章 结果与分析 21

3.1 融合表达载体的鉴定 21

3.1.1 目的蛋白cDNA电泳验证 21

3.1.2 rhaB1-EGFP片段验证 21

3.1.3 pET21a-rhaB1-EGFP融合表达载体结构验证 22

3.1.4 重组菌株的鉴定 23

3.1.5 小结 24

3.2 诱导表达条件筛选 24

3.2.1 诱导时间 24

3.2.2 诱导温度 25

3.2.3 诱导剂浓度 26

3.2.5 小结 27

3.3 目的蛋白的制备与分离纯化 27

3.3.1 SDS-PAGE和Western-blot 27

3.3.2 酶活力测定 28

3.3.5 小结 29

3.4 反应新体系的构建 29

3.4.1 产物结构验证 29

3.4.2 立体选择性分析 30

3.4.3 动力学分析 31

3.4.4 构建制备异槲皮苷新体系 32

3.4.5 小结 35

结  论 36

致  谢 37

参考文献 38

第一章 绪 论

1.1 鼠李糖苷酶的概述

1.1.1 鼠李糖苷酶的来源——柚皮酶

柚皮酶广泛存在于植物、动物和微生物中，第一例柚皮酶来源于芹菜籽[1]。目前柚皮酶的主要来源为微生物，含有柚皮酶的微生物有细菌、真菌和酵母等。真菌主要集中在黑曲霉（Aspergillus nige）和青霉菌（Penicillium notatum）两种类型；从目前的研究来看，细菌来源的柚皮苷酶种类较少，而酵母来源的柚皮酶主要来源于罗伦隐球酵母（Cryptococcus laurentii）[2]。柚皮酶的成分主要分为α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶，这两种成分在将果汁中的苦味物质柚皮苷被柚皮苷酶水解的过程有两步反应，首先柚皮苷酶在α-L-鼠李糖苷酶的作用下水解生成普鲁宁，接着在β-D-葡萄糖苷酶的催化作用下，生成柚皮素。柚苷酶催化分解柚皮苷为鼠李糖、普鲁宁、葡萄糖和柚皮素的过程，如图1.1所示。在果汁酶法脱苦过程中，α-L-鼠李糖苷酶参与的第一步反应是脱苦的关键，因此α-L-鼠李糖苷酶是柚皮苷酶及橙皮苷酶的主要活性成分，是去除柑桔类果汁苦味的有效物质[3]。Chien等[4]用HPLC法证明仅有柚皮苷酶的另一组份β-D-葡萄糖苷酶存在时，苦味物质柚皮苷是不能被水解的。因此，本文着重关注α-L-鼠李糖苷酶，并研究其催化能力。