图1.1 柚苷酶催化柚皮苷分解成鼠李糖、普鲁宁、葡萄糖和柚皮素

Figure 1.1 Hydrolysis of naringin by naringinase for rhamnose, probenin, glucose and naringenin.

1.1.2 鼠李糖苷酶基因型

现有的α-L-鼠李糖苷酶大部分属于水解酶GH78家族[5]，根据文献报道，这个家族的水解酶包含470个蛋白质，其中有13个蛋白质来源于古生菌，394个蛋白质来源于细菌，59个蛋白质来源于真核生物。这些蛋白质中有18个是同类型的。而来源于少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)的α-L-鼠李糖苷酶则属于水解酶GH106家族，其中包含86个细菌蛋白。水解酶中只有GH78和GH106家族构成了α-L-鼠李糖苷酶酶活的专一性[6]。此外，α-L-鼠李糖苷酶的基因型主要分为rhaA、rhaB，rhaA开放阅读框编码的蛋白质包含886个氨基酸，其分子量为98,280；rhaB开放阅读框编码的蛋白质包含956个氨基酸，其分子量为106,049。代表性微生物中编码α-L-鼠李糖苷酶的基因如表1.1所示。rhaA与来源于梭状芽胞杆菌(Clostridium stercorarium)的α-L-鼠李糖苷酶的同一性为41%，而rhaB与其他来源的α-L-鼠李糖苷酶的相似性较小。Abbate E等在E.coli中对rhaB超表达并分离纯化后发现，RhaB对鼠李糖具有高度专一性[7]，因此本文选用来自大象粪便宏基因组的rhaB1基因构建重组菌株，通过构建rhaB1基因型菌株发酵α-L-鼠李糖苷酶，生产纯α-L-鼠李糖苷酶以用于催化合成单一产物异槲皮苷。

表1.1 代表性微生物中编码α-L-鼠李糖苷酶的基因[8]

Table1.1 Representative Microorganism gene encoding α-L-rhamnosidase[8]

Gene source Name Accession number Year

C. sterorarium ramA AJ238748 2000

A. aculeatus rhaA/rhaB AF284761/AF284762 2001

Bacillus sp.GL1 rhaA/rhaB AB046705/AB046706 2003

Thermomicrobia bacterium PRI-1686 rhmA/rhmB AY505013/AY505014 2004

Sphingomona paucimobilis FP2001 rhaM AB080801 2005

A. acidophilus Ak-rhaA AB374267 2008

Loctobacillus acidophilus ramALa NC006814 2009

L. plantarum rhaB1/rhaB2 FJ943501 2009

Pediococcus acidiloctici ram/ram2 ZP_07367044/ZP_07366943 2011

A. terreus no menntion JN899401 2012

A. niger DLFCC-90 rhaR EU200666 2012

Xylaria polymorpha gh78-1 JN815084 2012

Alternaria sp.L1 rhaL1 JN704640 2012

A. nidulans rhaE FR873475 2012

Streptomyces avermitilis NBRC 14893 no mention BAC68538 2013

1.1.3 α-L-鼠李糖苷酶的提取

鼠李糖苷酶广泛存在于自然界的细菌和真菌中[3]，是植物细胞壁果胶多糖、糖蛋白以及二级代谢物。真菌中的α-L-鼠李糖苷酶最初是从青霉菌和曲霉菌代谢生产的酶制剂中纯化来的。其中，Jaap Visser等[9]主要使用阴离子交换色谱法分离提纯来源于黑曲霉的α-L-鼠李糖苷酶；Sarita Yadav等[10]主要使用超滤、阳离子交换柱层析法分离提纯来源于青霉菌的α-L-鼠李糖苷酶；Kurosawa等[11]通过使用CM纤维素和Sephadex G-150的柱色谱法，在酸性pH下进行热处理、冷冻和解冻，提纯来自海洋腹足动物T.cornutus的肝脏的β-L-鼠李糖苷酶；Qian等人用硫酸铵分级沉淀，透析和DEAE-纤维素离子交换色谱法提取α-L-鼠李糖苷酶。以上方法结果表明，均在较大程度上影响了酶活力。而本文通过6×His标记的Ni-TED 2000色谱柱分离纯化以获取α-L-鼠李糖苷酶的方法，对酶活力影响较小。

1.1.4 α-L-鼠李糖苷酶表达系统

α-L-鼠李糖苷酶表达系统主要分为原核表达和真核表达两种，根据其来源不同使用不同的表达系统，来源于细菌的α-L-鼠李糖苷酶使用细菌表达系统，真菌来源的α-L-鼠李糖苷酶使用真核表达系统。最早表达纯化获取α-L-鼠李糖苷酶的途径是从真菌中获取，如青霉菌和曲霉菌代谢生产的酶制剂。近年来，随着基因工程技术的发展，国内外涌现一大批通过基因工程手段构建α-L-鼠李糖苷酶生产菌株，以期高效生产α-L-鼠李糖苷酶。国内有关用微生物发酵α-L-鼠李糖苷酶的研究报道相对较少[12]，主要通过Absidia sp. R9g代谢产生的α-L-鼠李糖苷酶[13]。近期，国外关于使用微生物发酵生产该酶，主要是从黑曲霉、白曲霉、棘孢曲霉、青霉菌、拟杆菌属和热微菌门等菌种中提取。如Elin baum 等采用土曲霉固态发酵生产α-L-鼠李糖苷酶，以柚皮苷为诱导物和碳源，测得最大酶活力为4.2 U/mL；Gallego 等采用深层培养生产鼠李糖苷酶,以芸香苷为诱导物和碳源，发酵的酶活力为530.6 mU/mL[14]。据最新的文献报道，如2017年Yadav等[15]通过P. griseoroseum MTCC-9224发酵生产α-L-鼠李糖苷酶，并通过超滤和DEAE-纤维素上的阴离子交换色谱法进行浓缩获得纯酶，测得最大酶活力达到27 IU/mg。近年来，虽然有不少关于利用微生物发酵生产α-L-鼠李糖苷酶的报道，但酶活力均较低，这可能和野生型菌株发酵的次生代谢产物种类较多有关。