1 引言

纳米材料自20世纪70年代投入工业使用，并在半个世纪里得到了跳跃式的发展和应用，受到各行业关注。截至目前，纳米材料的主要应用领域有生物医学和健康、催化、航天航空、电子器件和环境、空间探索、资源和能量、生物技术等[1]。现代人每天都要接触大量不同种类的纳米材料, 其来源除了含有纳米材料的消费品如化妆品、纺织品以及运动用品等, 还有从汽车尾气甚至油烟中也能够不知不觉吸入纳米材料。目前接触纳米材料最频繁的是生产和研发人员, 进入人体最常见的途径为呼吸道和皮肤,其次为消化道[2]。

纳米氧化锌(ZnO NPs)是一种在生产工艺和检测方法上应用最早的纳米材料[3]。由于其具有不同于普通氧化锌所不具备的表面效应、体积效应、量子尺寸效应和宏观隧道效应以及高透明度、高分散性等特点，因此其在化工、电子、光学、生物、医药等许多领域有重要的应用价值。纳米氧化锌化学活性高、在体内吸收率高、具有较强的生物毒性。研究发现，纳米氧化锌具有显著的生物毒性，包括有肝毒性，胃肠毒性，心肺毒性等[4]。氧化应激是目前最为普遍接受的纳米材料致毒机制[5]，是导致细胞过氧化损伤、产生大量过氧化产物的原因，并能通过自身遗传机制的调节诱导细胞凋亡。截止目前，针对纳米氧化锌诱导的呼吸道系统毒性的影响研究尚有不足。

抗氧化剂是一类能有效抑制或延缓自动氧化的物质，Halliwell[6]将其定义为：在相对可氧化底物（糖类、脂质、DNA或蛋白质）更低的浓度下，能有效地延缓或阻止底物发生氧化反应的物质。天然抗氧化剂是从天然动植物中提取的抗氧化物质，具有纯天然、低毒性、强氧化性等特点，因而在实际应用中逐渐替代人工合成抗氧化剂。目前已开发利用或正在研究的天然抗氧化剂主要有香辛料提取物、茶多酚类、天然黄酮类、维生素类、蛋白类和酶类、类胡萝卜素、植酸、中草药提取物等几类物质。表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）一种典型的茶多酚类的天然抗氧化剂。

茶是中国消耗量最大的饮品之一，被广泛认为具有一定的保健作用。茶多酚是茶叶中多酚类活性物质的总称，而EGCG是绿茶中最有效的抗氧化多酚。大量研究报道称EGCG 能够抗氧化[7]、增强免疫力[8]。同时，EGCG在抑制乙醇诱导大鼠氧化损伤胞内的MDA、H2O2含量[9]、抑制原癌基因p53的表达，增加抗凋亡基因Bcl-2的表达[10]、减少由H2O2导致的人胚肺成纤维细胞（HPF-1细胞）氧化损伤[11]、清除铁诱导的脑突触体氧自由基[12]方面发挥巨大作用。

因此本研究采用不同粒径的纳米氧化锌作为主要污染物，大鼠气管上皮细胞作为靶细胞，研究EGCG对不同粒径的纳米氧化锌诱导的呼吸道上皮细胞氧化应激的保护作用，为纳米氧化锌诱导的呼吸系统毒效应及其机理研究提供一定的理论依据，同时为未来天然抗氧化剂的药用价值提供依据。

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 试验细胞

本项研究试验采用大鼠气管上皮细胞(RTE细胞)选购自北京北纳创联生物技术研究院，为第二代细胞，细胞状态良好。

2.1.2 毒素和试剂

DMEM培养基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶消化液（Trypsin）、谷氨酰胺、丙酮酸钠均购买自美国Gibco公司。磷酸盐缓冲液（PBS）、双抗青链霉素、二甲基亚砜（DMSO）均购买自美国Sigma-Aldrich公司。Cell Counting Kit-8试剂盒购买自日本同仁化学研究所（Dojindo）。活性氧ROS试剂盒及丙二醛MDA试剂盒均购买自南京建成生物研究所。

2.2 实验方法

2.2.1 细胞培养与诱导

RTE细胞用DMEM（含10％新生胎牛血清，100 μg/mL 青霉素和100 μg/mL 链霉素）培养基，置于5％CO2、37℃细胞培养箱中培养。待显微镜下观察到细胞饱和度达70 ％-80 ％时，将RTE细胞使用PBS 缓冲液浸洗一次后，加入适量的0.25 ％胰蛋白酶使细胞消化分装或制成细胞悬液接种到96孔板中，注意96孔板外周孔内加PBS缓冲溶液以避免边缘效应。然后把RTE细胞分别暴露于不同粒径的纳米氧化锌溶液（30 nm和90 nm），暴露浓度为10 μg/L, 100 μg/L, 1 mg/L和10 mg/L，同时进行100 μg/L与10 mg/L浓度的纳米氧化锌与不同浓度的EGCG（10 μg/L, 100 μg/L, 1 mg/L）混合溶液暴露，暴露时间为12 h。